测定意义

MAO(EC1.4.3.4) 主要存在于脊椎动物的各种器官，特别是分泌腺、脑、肝脏，在无脊椎动物、豆类的芽等植物中也存在催化单胺类物质代谢，含量较低，具有重要的生理功能，其活性能反映肝纤维化的程度。此外，MAO活性异常导致细胞内单胺类神经递质运转出现紊乱，从而引发多种病症。

测定原理：

MAO催化单胺类底物脱氨生成相应的醛，进一步氧化成酸；底物在360nm处有特征吸收峰，测定360nm光吸收下降的速率，计算MAO活性。

自备实验用品及仪器：

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、1 mL玻璃比色皿/96孔板、蒸馏水。

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.        加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.        弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜, 37℃反应60分钟。

3.        温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.        每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液） 100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.        温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.        依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.       依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.       用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

1、细胞或组织样品的制备：

培养细胞：先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml提取液），超声波破碎细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。