鉴定DNA结合的蛋白-DNA Pull Down技术服务

鉴定DNA结合的蛋白-DNA Pull Down技术服务

常见问题：

Q1：DNA Pull Down的原理是什么？

A：DNA Pull Down是根据启动子区域，设计DNA探针并进行标记，标记的探针结合到链霉亲和素修饰的磁珠上，形成磁珠-探针复合体。将磁珠-探针复合体与提取的蛋白孵育，鉴定与DNA探针有特异性结合的蛋白质。

Q2：探针的设计原则是什么，长度为多少个碱基比较合适？

A：启动子的长度一般为100-1000 bp，我们建议选择起始密码子上游1000 bp的序列，根据这1000 bp的序列，来设计DNA探针。我们建议探针长度在100 bp-500 bp之间，如果探针序列太短，会降低与蛋白的亲和能力；反之，如果探针序列太长，则会增加非特异性结合。

Q3：做DNA Pull Down的探针，用单链好还是用双链好？

A：转录因子是与启动子区特定的motif结合，DNA双链的正义链和反义链上都可能会有转录因子的结合位点。转录因子与DNA的结合依赖于氢键和范德华力，双链DNA能够增加转录因子与DNA的结合能力。

Q4：一般会找到多少个转录因子，成功率是多少，有没有成功的案例？

A：由于DNA Pull Down的特异性强，假阳性率低，根据我们的实际经验，一条DNA探针能够结合1-6个转录因子。我们目前所做的项目，成功率为80%。我们鉴定出了作物、花卉和木本植物的WRKY、MYB、HD-ZIP、MADS、HSF等转录因子。

Q5：本实验的难点在哪里，影响DNA Dull Down实验的因素有哪些？

A：由于样本的种类多种多样，转录因子的表达丰度低，本实验的难点在于样本细胞核的分离、细胞核蛋白的提取。影响DNA Dull Down实验的因素主要有蛋白的表达丰度、蛋白和DNA结合的强弱程度等。

Q6：SDS PAGE之后，为什么用银染，而不是考染？

A：由于提取或洗脱的蛋白丰度低，所以使用银染进行SDS PAGE后的染色，银染检测灵敏度高，能够检测到ng级的蛋白质。通过银染，也能够判断蛋白提取的质量，以及Pull Down之后蛋白洗脱的效果。

Q7：为什么实验的对照组也能够鉴定出蛋白？

A：如果物种蛋白数据库完整度低、肽段注释质量差，则需要进行全库搜索。全库搜索，对于负对照和实验组来说，往往有非特异性蛋白或肽段。这是因为有一些蛋白能够与磁珠非特异性结合；另外，配制实验缓冲液所用的原料试剂、在实验过程中会有外部环境蛋白的污染，比如人的角蛋白污染。由于质谱鉴定的灵敏度很高，即使有痕量的蛋白污染，也会被检测出来。

Q8：后续的验证可以选择哪些实验？

A：后续可以使用酵母单杂交、EMSA、LUC等实验做进一步验证。