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蛋白质测定仪在慈姑蛋白质测定中运用

来源: 杭州麦哲仪器有限公司

2013/6/13 16:05:44 476

  慈姑又名燕尾草、剪刀草,为泽泻科多年生水生草本植物,《本草纲目》收载品种,原产我国,喜温和充足的阳光,常利用低洼水田种植。慈姑含有多种营养成分,每100g鲜慈姑中含碳水化合物15.4g,蛋白质5.4g,脂肪0.3g,还含有Ca、P、Fe、Zn、Cu等矿物质营养,以及VC、VE和硒等抗氧化成分。因此,本试验以大理产慈姑为原料经水提醇沉提取提得粗多糖,再经SEVag脱蛋白后得精制慈姑多糖,并用微量凯氏定氮法测定粗多糖和精制多糖中蛋白质含量。此方法,准确度高,误差小于±2%,蛋白质含量的测定可以直接使用蛋白质测定仪进行测定分析。
  1.1 材料
  新鲜慈姑购于云南大理市农贸市场,产于云南省大理市凤仪镇,新鲜慈姑洗净,切片晒干,粉碎备用。石油醚(沸程60~90℃)、无水乙醇、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、氢氧化钠、盐酸、溴甲酚绿、甲基红等,均为分析纯。
  1.2
  主要仪器
  型电子分析天平;数显恒温水浴锅;低速离心机,旋转蒸发仪,凯氏定氮仪,酸碱滴定管等。
  2 方法
  2.1慈姑多糖的提取
  称取慈姑粉200g中加入10倍体积的石油醚于回流装置中,60℃回流3h,过滤,滤渣晾干,用10倍体积80%乙醇80℃回流2h,以除去单糖、多酚、低聚糖和甙类小分子物质,过滤,滤渣晾干得脱脂慈姑样品。称取脱脂慈姑样品2份,每份100g,按料液比1∶15(g/ml)加入蒸馏水,于70℃水浴浸提3h,过滤,滤渣重复浸提1次,合并提取液,适当浓缩,加入95%的乙醇,使乙醇终浓度达80%。充分搅拌后4℃下静置24h,离心收集沉淀。一份沉淀真空干燥,得慈姑多糖粗品;另一份溶于少量蒸馏水中,用SEVagE法(多糖溶液∶氯仿∶正丁醇=25∶5∶1)脱蛋白,反复进行至无蛋白层后,取水层加入95%的乙醇,使含醇量达到80%,充分搅拌后4℃下静置24h,离心收集沉淀,并用无水乙醇、乙、丙酮反复洗涤多次,真空干燥,得慈姑多糖精品。
  2.2 慈姑多糖中蛋白质含量的测定
  2.2.1 消化
  准确称取烘干至恒重的慈姑多糖样品5.0g加去离子水定容50ml为待测样品溶液。0.5g K2SO4加入消化管底部,加2~3粒小玻珠(防沸),加入1ml待测样品溶液及2ml消化液(2%CuSO4溶液与浓H2SO4按体积比为1∶4的混合溶液),轻轻摇匀后将消化管放在有铁丝箩的电炉上,在瓶口倒置一漏斗,放在通风橱中,电炉直接加热进行消化,在消化过程中时常转动消化管,使全部样品都浸泡在硫酸溶液中,以保证样品消化*。消化液褪色消失,呈现淡绿色时消化即告完毕。为了保证消化的*完成,在溶液透明后继续加热1h,冷却至室温。同时以1ml去离子水代替待测样品溶液同样操作做空白对照实验。
  2.2.2 蒸馏
  装好定氮蒸馏装置,于水蒸气发生瓶内装水约2/3处,加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,再加入数粒玻璃珠以防暴沸,加热煮沸水蒸气发生瓶内的水,经水蒸气洗涤装置10min至10ml 2%硼酸指示剂混合液不变色,表示仪器已经洗涤干净。量取2%硼酸吸收液10ml置150ml的锥形瓶内,滴加混合指示液1~3滴,并使冷凝管下端插入液面下,将样品消化管内的样品由小玻璃杯流入凯氏蒸馏器内,用约20ml蒸馏水冲洗消化管及小玻璃杯3次,使洗涤液流入反应器内,塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。再将8ml 50%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯,提起玻璃塞使其缓慢流入反应室,立即将玻璃盖塞紧,并加蒸馏水于小玻璃杯作水封以防漏气。夹紧夹子,开始蒸馏,蒸气通入反应室使氨通过冷凝管进入接收瓶内。从第1滴蒸馏液滴下起计时,蒸馏5min后,移动接收瓶,使冷凝管下端离开液面,再蒸馏1min,使氨全部蒸出,可用精密pH试纸测冷凝管口的冷凝液来测定蒸馏是否完毕,中性则说明已蒸馏*。然后用少量去离子水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶。同时空白管按上述方法操作。
  2.2.3滴定
  全部蒸馏完毕后,用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定上述馏出液,直至硼酸混合指示剂由绿色变回淡紫红色,即为滴定终点。记录盐酸溶液体积的消耗量,平行做五组,取平均值;同时做一空白对照。
  2.2.4 计算
  蛋白质(%)=C×(V1-V2)×M/Nm×1000×F×100
  式中:C为盐酸溶液的浓度(mol/L);V1为滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液的体积(ml);V2为滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液的体积(ml);F为蛋白质系数(6.25);MN为氮的摩尔质量(14.01g/mol);m为称量样品的质量(g)。
  3 结果


  结果慈姑粗多糖中蛋白质含量为5.80%,经SEVag脱蛋白后的慈姑多糖中蛋白质含量为2.67%。原因是SEVag法适用于游离蛋白的去除,但无法除去多糖中的游离蛋白。因此,经水提醇沉法所得的慈姑多糖中除了游离蛋白外,还含有较多的结合蛋白,游离蛋白和结合蛋白含量分别为3.13%、2.67%。

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