慈姑又名燕尾草、剪刀草，为泽泻科多年生水生草本植物，《本草纲目》收载品种，原产我国，喜温和充足的阳光，常利用低洼水田种植。慈姑含有多种营养成分，每100g鲜慈姑中含碳水化合物15.4g，蛋白质5.4g，脂肪0.3g，还含有Ca、P、Fe、Zn、Cu等矿物质营养，以及VC、VE和硒等抗氧化成分。因此，本试验以大理产慈姑为原料经水提醇沉提取提得粗多糖，再经SEVag脱蛋白后得精制慈姑多糖，并用微量凯氏定氮法测定粗多糖和精制多糖中蛋白质含量。此方法，准确度高，误差小于±2%，蛋白质含量的测定可以直接使用蛋白质测定仪进行测定分析。
1.1 材料
新鲜慈姑购于云南大理市农贸市场，产于云南省大理市凤仪镇，新鲜慈姑洗净，切片晒干，粉碎备用。石油醚（沸程60～90℃）、无水乙醇、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、氢氧化钠、盐酸、溴甲酚绿、甲基红等，均为分析纯。
1.2
主要仪器
型电子分析天平；数显恒温水浴锅；低速离心机，旋转蒸发仪，凯氏定氮仪，酸碱滴定管等。
2 方法
2.1慈姑多糖的提取
称取慈姑粉200g中加入10倍体积的石油醚于回流装置中，60℃回流3ｈ，过滤，滤渣晾干，用10倍体积80%乙醇80℃回流2ｈ，以除去单糖、多酚、低聚糖和甙类小分子物质，过滤，滤渣晾干得脱脂慈姑样品。称取脱脂慈姑样品2份，每份100g，按料液比1∶15（g/ml）加入蒸馏水，于70℃水浴浸提3ｈ，过滤，滤渣重复浸提1次，合并提取液，适当浓缩，加入95%的乙醇，使乙醇终浓度达80%。充分搅拌后4℃下静置24ｈ，离心收集沉淀。一份沉淀真空干燥，得慈姑多糖粗品；另一份溶于少量蒸馏水中，用SEVagE法（多糖溶液∶氯仿∶正丁醇＝25∶5∶1）脱蛋白，反复进行至无蛋白层后，取水层加入95%的乙醇，使含醇量达到80%，充分搅拌后4℃下静置24ｈ，离心收集沉淀，并用无水乙醇、乙、丙酮反复洗涤多次，真空干燥，得慈姑多糖精品。
2.2 慈姑多糖中蛋白质含量的测定
2.2.1 消化
准确称取烘干至恒重的慈姑多糖样品5.0g加去离子水定容50ml为待测样品溶液。0.5g Ｋ2SＯ4加入消化管底部，加2～3粒小玻珠（防沸），加入1ml待测样品溶液及2ml消化液（2%ＣｕSＯ4溶液与浓Ｈ2SＯ4按体积比为1∶4的混合溶液），轻轻摇匀后将消化管放在有铁丝箩的电炉上，在瓶口倒置一漏斗，放在通风橱中，电炉直接加热进行消化，在消化过程中时常转动消化管，使全部样品都浸泡在硫酸溶液中，以保证样品消化*。消化液褪色消失，呈现淡绿色时消化即告完毕。为了保证消化的*完成，在溶液透明后继续加热1ｈ，冷却至室温。同时以1ml去离子水代替待测样品溶液同样操作做空白对照实验。
2.2.2 蒸馏
装好定氮蒸馏装置，于水蒸气发生瓶内装水约2/3处，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，再加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水，经水蒸气洗涤装置10min至10ml 2%硼酸指示剂混合液不变色，表示仪器已经洗涤干净。量取2%硼酸吸收液10ml置150ml的锥形瓶内，滴加混合指示液1～3滴，并使冷凝管下端插入液面下，将样品消化管内的样品由小玻璃杯流入凯氏蒸馏器内，用约20ml蒸馏水冲洗消化管及小玻璃杯3次，使洗涤液流入反应器内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。再将8ml 50%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加蒸馏水于小玻璃杯作水封以防漏气。夹紧夹子，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管进入接收瓶内。从第1滴蒸馏液滴下起计时，蒸馏5min后，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min，使氨全部蒸出，可用精密ｐＨ试纸测冷凝管口的冷凝液来测定蒸馏是否完毕，中性则说明已蒸馏*。然后用少量去离子水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶。同时空白管按上述方法操作。
2.2.3滴定
全部蒸馏完毕后，用0.01mol/Ｌ盐酸标准溶液滴定上述馏出液，直至硼酸混合指示剂由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点。记录盐酸溶液体积的消耗量，平行做五组，取平均值；同时做一空白对照。
2.2.4 计算
蛋白质（%）＝Ｃ×（V1－V2）×Ｍ/Ｎｍ×1000×Ｆ×100
式中：Ｃ为盐酸溶液的浓度（mol/Ｌ）；V1为滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液的体积（ml）；V2为滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液的体积（ml）；Ｆ为蛋白质系数（6.25）；ＭＮ为氮的摩尔质量（14.01g/mol）；ｍ为称量样品的质量（g）。
3 结果
结果慈姑粗多糖中蛋白质含量为5.80%，经SEVag脱蛋白后的慈姑多糖中蛋白质含量为2.67%。原因是SEVag法适用于游离蛋白的去除，但无法除去多糖中的游离蛋白。因此，经水提醇沉法所得的慈姑多糖中除了游离蛋白外，还含有较多的结合蛋白，游离蛋白和结合蛋白含量分别为3.13%、2.67%。
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