研究背景

       心肌细胞（CMs）是心脏的肌肉细胞，通过跳动产生机械张力来维持心脏功能。CMs的机械输出来源于沿肌纤维排列的肌节的缩短。人iPS可以分化为跳动的CMs（hiPSC-CMs），但hiPSC-CMs中肌原纤维紊乱，不像原代CMs中那样排列整齐，这种混乱一直是应用hiPSC-CMs进行体外心功能分析的限制因素。基质微图案化培养hiPSC-CMs可以成功诱导胞内肌原纤维对齐，从而增强收缩机制的成熟度，并可将这些工程细胞作为心脏收缩力的模型。在已知机械性能的柔性基质上微图案化培养hiPSC-CMs，通过wuchuang和微创显微法可计算机械输出（图1A）。此外通过明视野显微镜获得的搏动细胞影像，也可跟踪细胞运动，使用可变形微柱做基质可测量细胞力。还有研究用构建的包括hiPSC-CMs或与其他细胞共培养在内的多细胞系统对机械输出进行了研究。诱导胞内肌原纤维排列是加速hiPSC-CMs收缩成熟的关键，而肌原纤维在单细胞系统中更容易成像，可实现活细胞分析。

       本文所述的平台整合了不同成像类方法来分析微图案化hiPSC-CMs的机械输出，得到了表征细胞机械输出的一系列参数。还利用该多重成像组合方法测量了肌节长度，量化了收缩缺陷细胞中收缩运动的不同步性。检测了药物对hiPSC-CMs和MYBPC3基因导致收缩缺陷的细胞的机械输出的影响。证明该方法能够分析药理学条件下或心脏病模型中的心脏收缩情况。

测定原理

       在每一次搏动中，心肌细胞（CMs）通过收缩机制产生心脏功能所需的机械输出，收缩机制包括肌节沿肌原纤维缩短。人诱导多能干细胞（hiPSCs）可分化为CMs（hiPSC-CMs），通过微图案化形成生理形状可作为模型，稳定地模拟心脏收缩机械输出。量化这些细胞的机械输出可实现在培养皿中分析心脏活动。

测定参数

       研究使用了Plexithermo HCell系列单心肌细胞功能检测系统。ZeissAxiovert 200M倒置显微镜，搭载Zeiss Axiocam MRm CCD相机获取视频，分析细胞收缩周期的机械输出（图1A）。获得三类视频：明场视频、基质中荧光微珠的视频、荧光肌原纤维视频，显示了基质、细胞表面和肌原纤维的运动。量化每帧移动结构（细胞、微珠和肌原纤维）的平均位移（d）和移动速度（V）。使用牵引力显微镜通过基质的位移估算收缩力，计算了由牵引应力产生的力向量（F）的大小。F求和（ΣF），乘以V得到功率（P）。根基这些特征（d, V, ΣF, P）绘制的曲线确定参数，采用互相关算法Ncorr20以时间计算d和V（图1B-F）。通过细胞边界确定感兴趣区域（ROI），根据ROI确定成比例的椭圆范围，测量其中微珠的运动，得到其d曲线（图1F）和V曲线（图1G）。计算每帧的∑F，得到F曲线（图1H）。利用时间绘制P（图1I），量化肌原纤维运动（图1J）来确定d曲线（图1K）和V曲线（图1L）。由d曲线得到细胞搏动率（br）。由d曲线和F曲线的峰值得到峰位移（dmax）和峰值力（ΣFmax）。通过V曲线确定收缩（VC）和舒张（VR）的峰值速度。通过P曲线确定收缩（PC）和舒张（PR）的峰值功率。时间参数（t­）表示收缩和舒张峰值间的时间（图2A）。通过肌原纤维视频量化sl。胞外添加kafeiyin验证以上参数的描述效果。证明图像分析获得的收缩和运动参数能够可靠地描述细胞的机械输出。

图1 通过显微镜视频获得hiPSC-CMs的收缩机械输出。（A）显微镜获得的三种视频。（B）根据细胞轮廓确定ROI，明场视频互相关算法分析该区域运动。（C）收缩活动产生的细胞平均位移（d）。（D）细胞位移的平均速度（V）。（E）荧光视频计算微珠的平均位移（d）。（F）微珠的d曲线与时间的函数。（G）微珠V曲线与时间的函数。（H）收缩力（ΣF）。（I）功率（P）。（J）肌原纤维中肌节占据的区域发生了骨骼化。（K）J中细胞肌原纤维的d曲线。（L）J中细胞的肌原纤维V曲线。

图2 通过绘图得到收缩周期参数。（A）通过V曲线确定代表每个收缩周期的3个动力学参数：VC为zuida收缩速度，VR为zuida舒张速度，t为两峰值间的时间。（B）增加kafeiyin浓度微珠d曲线的变化情况。（C）增加kafeiyin浓度功率P的变化情况。

       通过异丙醇（ISO）和omecamtiv mecarbil (OM)诱导hiPSC-CMs机械输出变化，利用以上参数描述细胞变化，验证了参数可靠性，可用于量化不同浓度药物引起的收缩变化（图3，图4）。

图3 异丙肾上腺素（ISO）引起的机械输出变化。（A）牵引力显微镜测定细胞产生的牵引应力的热图。（D）荧光标记肌原纤维，成像以量化肌原纤维移动。根据ISO处理前后的微珠视频获得F曲线（B）和P曲线（C）。根据ISO处理前后的肌原纤维视频获得d曲线（E）和V曲线（F）。（G）明场视频，获得不同浓度ISO时的d曲线（H）和V曲线（I）。

图4 检测omecamtiv mecarbil (OM)引起的hiPSC-CM机械输出变化。（A）添加OM前的肌原纤维。（B）添加后10s内肌节急性收缩。（C）添加2min后肌节出现慢性损伤。通过微珠视频获得添加OM前及产生急慢性现过后的F曲线（D）和P曲线（E）。通过肌原纤维视频获得d曲线（F）和V曲线（G）。通过细胞明场视频获得d曲线（H）和V曲线（I）。

       此外通过肌节视频还可量化ISO和OM引发的收缩周期中肌原纤维的肌节长度（sl）和缩短（ss）变化（图5），以及分析收缩缺陷细胞中，胞内运动的不同步性（图6）。证明该多成像方法可靠且灵活多用。

图5 ISO和OM引发的肌节长度（sl）和缩短（ss）变化。通过肌节视频测量sl和ss。（A, E）平均sl的箱型图。（B, F）sl zuida值。（C, G）sl最小值。（D, H）sl zuida值减去sl最小值得到ss。

图6 编码MYBPC3基因纯合子和杂合子敲除的hiPSC-CMs中，空间（αθ）或时间（αδ）不同步性的测量参数。（A）每个像素位移峰的时间减去ROI平均位移的位移峰的时间，得到每个像素i的δ。（B）明场视频中的ROI示意。（C）ROI中像素的δ的热图。（D-G）缺乏两个拷贝（-/-）或缺乏一个拷贝（+/-）hiPSC-CMs中获得的参数。（D）αθ。（E）αδ。（F）t。

研究结论

       本文的多成像方法不仅可表征单个hiPSC-CMs的心脏功能，还可确定阐明CM功能变化的机制的收缩参数。通过异丙肾上腺素实验，验证了该平台可检测不同药物浓度下的收缩变化，通过OM实验证明了检测同一药物急性和慢性影响的必要性。此外该方法侵入性小，且对数据获取和分析能力要求低，拓宽了应用范围。总之，本文的多成像平台量化了评估hiPSC-CMs收缩性能的关键参数。考虑到肌节和收缩运动与力产生的关联，该平台为测量收缩表型提供了多种角度和方法。

参考文献：

Ribeiro,  A. J. , et al. "Multi-Imaging Method to Assay the Contractile  Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac  Myocytes." Circulation Research (2017):1572-1583.