杜氏肌营养不良（DMD）是一种罕见的X连锁隐性疾病，与严重的进行性肌肉退化有关，最终因心肺衰竭而死亡。有研究在DMD小鼠模型的心肌细胞中观察到了增殖非依赖性端粒缩短。Alex C.Y. Chang等使用人诱导多能干细胞分化的心肌细胞（hiPSC-CMs），结合HCells高通量单细胞功能检测系统，发现DMD hiPSC-CMs在纤维化样生物工程水凝胶上显示出力产生缺陷、钙处理异常以及活性氧水平增加。此外还观察到DMD hiPSC-CMs有丝分裂后端粒的逐渐缩短与shelterin复合物、端粒帽蛋白的下调和p53 DNA损伤应答的激活同时发生。这种端粒缩短可被抑制DMD心肌细胞收缩的（布雷他汀）blebbistatin阻断。研究强调了纤维化硬化在DMD心肌病病因中的作用，得到数据表明端粒缩短是渐进的、收缩依赖的，并且机械力敏感，为治疗干预提供了见解。文章以“Increased tissue stiffness triggers contractile dysfunction and telomere shorteningin dystrophic cardiomyocytes”为题发表于Stem Cell Reports。

背景

       杜氏肌营养不良症（DMD）是由编码dystrophin（一种连接细胞骨架和细胞外基质的蛋白）的基因中，> 200个突变引起的，发病率为1:5,000，DMD患者表现出早期和进行性骨骼肌退化和无力，通常在30岁之前死于扩张型心肌病和呼吸衰竭。DMD在心脏中的表现为心电图异常、收缩和舒张功能障碍、纤维化，最终导致心力衰竭。AAV介导的基因治疗和基因编辑策略在动物模型中显示出巨大前景。但因为缺乏对心力衰竭机制的理解，DMD患者接受的还是非特异性心力衰竭治疗，如β受体阻滞剂或ACE抑制剂。

       以前发现dystrophin缺乏与较短的端粒有关，端粒是六核苷酸TTAGGG重复序列，覆盖并保护染色体末端。通过用mdx4cv和TERC敲除（mTR）小鼠繁育出的mdx4cv/mTRG2小鼠可如实再现扩张型心肌病表型。定量荧光原位杂交（Q-FISH）测得mdx4cv/mTRG2小鼠和DMD患者心脏组织中，心肌细胞的端粒与mdx4cv/mTRHet小鼠对照或同龄人对照的端粒相比，信号减少了约50%。但这种与增殖无关的端粒缩短的触发机制仍然未知。

       为深入了解端粒缩短的分子和细胞病因，研究人员使用由患者分化来的心肌细胞和同基因对照人类诱导多能干细胞（hiPSC-CMs），构建了培养条件下的人DMD心肌病模型，并绘制疾病进展图，这是一种用于研究心脏缺陷的强大系统。重要的是，建立了一个生物工程平台，允许心肌细胞以1:7的纵横比定向生长并模拟DMD纤维化心脏的硬度。发现DMD hiPSC-CMs表现出异常的钙处理、收缩缺陷和与增殖无关的端粒缩短。这种端粒缩短发生于有丝分裂后，是进行性的，且受收缩影响。通过在模拟健康和纤维化心肌硬度的生物工程平台上培养hiPSC-CMs，发现DMD心脏的心肌硬度特征会加剧收缩功能障碍。

结果

01-杜氏hiPSC-CMs可再现扩张型心肌病的致病特征

       为研究DMD hiPSC-CMs端粒缩短的分子基础，将6个DMD和6个对照hiPSC-CMs细胞系分化为跳动的心肌细胞。使用了来自四个不同实验室的来源于不同细胞类型的hiPSC细胞系，包括两个通过CRISPR-Cas9（Con1和2对应DMD1和2）纠正dystrophin突变的同基因对，一个通过CRISPR-Cas9（Con3对应DMD3）将前六个外显子的缺失引入健康细胞的同基因对，三个非家族健康对照（Con 4，5和6），和三个DMD细胞系（DMD4，5和6）。免疫荧光染色测定hiPSC的多能性标记物OCT4、NANOG和SOX2（图1B），跳动的心肌细胞确定表达标志蛋白、心肌肌钙蛋白（c替恩替）和α-actinin（图1C）。免疫荧光（图1D）和qRT-OCR（图1E）确定dystrophin的存在与否。

图1 DMD hiPSC-CMs的产生。（A）hiPSC分化产生hiPSC-CMs的步骤。（B）多能干细胞标志物染色OCT4、NANOG、SOX2。（C）心脏troponin T、α-actinin、DAPI染色。（D）健康和和DMD hiPSC-CMs的dystrophin、心脏troponin T、DAPI染色。（E）hiPSC-CMs中内源性dystrophin和utrophin (UTR)表达水平。

       1 Hz起搏条件下用Fura2测量以评估基础钙水平。观察到静息钙比率变化增加（图2A）、峰值钙比率下降趋势（图2B）、瞬时振幅下降（图2C）、除Con2/DMD2外到达峰值的时间无差异（图2D）、90%钙瞬变持续时间（图2E）、衰减τ增加（图2F）。与之前使用Fluo-4方法观察到的自发钙瞬变趋势类似。与对照组相比，DMD hiPSC-CMs表现出钙瞬变异常，除Con2/DMD2外瞬变幅度降低、到达峰值的时间延迟、TD50延长，但衰减τ没有差异，与先前在DMD和其他遗传性扩张型心肌病hiPSC-CMs中表征的钙瞬变类似。总之，使用两种不同的钙瞬变成像方法证实了DMD hiPSC-CMs钙处理异常。

图2 DMD hiPSC-CMs表现出钙处理异常。（A）静息，（B）峰值，（C）瞬移幅度，（D）到达峰值的时间，（E）90%钙瞬变持续时间，（F）衰减τ。

02-当受到增加的机械负荷时，DMD hiPSC-CMs表现出收缩力产生障碍

       为测量DMD hiPSC-CMs的收缩力，开发了一个牵引力显微镜平台，使用可调水凝胶模拟纤维化发生前（10kPa）和后（35kPa）的心脏组织硬度（图3A）。通过微图案化将单个hiPSC-CMs构建为7:1长宽比，这是成体心肌细胞的特征，可促进HiPSC-CMs肌节排列和成熟。牵引力显微镜平台捕捉单个心肌细胞产生的力，作为水凝胶变形的函数，通过跟踪嵌入的荧光微珠（图3B），使用傅立叶变换牵引细胞术重建牵引应力。测量DMD和10和35kPa水凝胶装置上培养的健康hiPSC-CMs中，几个收缩周期中的收缩参数，包括力和速度（图3C。

       35kPa条件下，与对照组相比，DMD hiPSC-CMs中力的产生显著减少，但10kPa水凝胶中没有（图3D）。35kPa水凝胶上的DMD hiPSC-CMs还显示收缩速度（图3E）、舒张速度（图3F）和细胞表面积（图3G）降低，与钙处理方面的测量结果一致。仅在35kPa基质上培养的DMD hiPSC-CMs中出现收缩缺陷，这一事实表明一旦心脏组织经历纤维化硬化（DMD心肌病的一个标志），DMD心肌细胞就无法补偿dystrophin缺陷。

       实验测得基础条件下，DMD hiPSC-CMs的活性氧（ROS）增加，但线粒体呼吸没有差异。已知心肌细胞在心力衰竭条件下会转变为糖酵解代谢。实验发现在营养缺乏条件下，如仅含葡萄糖、仅含丙酮酸盐或仅含棕榈酸盐，DMD hiPSC-CMs基础耗氧率和zuida耗氧率显著降低。表明DMD hiPSC-CMs表现出代谢适应不良和收缩功能障碍，与DMD心力衰竭进展中的观察结果类似。

图3 纤维化微环境处理下DMD hiPSC-CMs表现出收缩功能障碍。（A）牵引力显微镜评估DMD hiPSC-CMs收缩。（B）10或35kPa水凝胶上单个hiPSC-CMs产生的收缩力。（C）收缩周期。（D）力，（E）收缩速度，（F）舒张速度和（G）细胞面积。

03-没有细胞分裂情况下的端粒缩短

       探究了DMD hiPSC-CMs是否会表现出端粒缩短，与人DMD心脏组织心肌细胞和mdx4cv/mTRG2心脏组织类似。使用Q-FISH测量了一段时间内增殖性hiPSCs和分化的hiPSC-CMs的端粒信号（图4A和4B）。增值性hiPSCs的端粒信号与健康对照和DMD hiPSCs，或三个等基因对间无统计学差异（图4C）。

       伴随着衰老过程中每个细胞分裂的不*复制，端粒损失通常是一个“被动”过程。通过hiPSC-CM平台能够测试心肌细胞在没有DNA复制和细胞分裂的情况下是否也会发生端粒缩短。已知小鼠和人出生后发育期间，心肌细胞大多处于有丝分裂后期。通过EdU掺入法测定端粒长度及DNA复制，评估了hiPSC-CMs分化的一段时间，其中第0天被定义为分化的diyi天（图4D、4E）。发现与DMD小鼠（mdx4cv/mTRG2）和DMD患者结果一致，DMD hiPSC-CMs端粒较对照组逐渐缩短，在第30天端粒减少了50%（图4D）。EdU标签显示，在第16天仍发生增殖，但在第20天至第30天之间增殖停止（图4E）。正是在有丝分裂后的这段时间里，观察到DMD hiPSC-CMs端粒与对照组相比发生进行性减少，最终在第30天减少了约50%（图4D）。

图4 DMD hiPSC-CMs表现出端粒缩短和DNA损伤应答。（A）Q-FISH量化端粒长度（TelC）。（B）心脏troponin T、TelC、DAPI染色的hiPSC-CMs。（C）Q-FISH量化hiPSC端粒。（D）第20-30天间DMD hiPSC-CMs逐渐出现端粒丢失。（E）第20-30天hiPSC-CMs缺乏EdU。

       假设端粒缩短的早期分子触发因素可能是端粒失去覆盖的外壳蛋白。研究人员分离了第20天，即非增殖出现端粒缩短时的心肌细胞，TMRM染色评估线粒体膜电位，流式细胞仪富集hiPSC-CMs。qRT-PCR显示与对照hiPSC-CMs相比，端粒缩短DMD中端粒重复结合蛋白（TRF1和TRF2）和shelterin复合蛋白（RAP1、TIN2和POT1）的转录水平降低。为确定端粒缩短是否激活了DNA损伤应答，评估了p53水平（图5A）、每个单细胞p53结合蛋白1（53BP1）foci数（图5B和5D）和p21水平（图5C和5E）。发现DMD hiPSC-CMs中p53蛋白上调（图5A），对照组和DMD组中53BP1阳性hiPSCCMs的发生率从10%增加到50%（图5）。此外，53BP1的积累与p53下游靶向p21蛋白的表达相关（图5C和5E）。如53BP1升高所示，DNA损伤应答的激活诱导p53介导的PGC-1a抑制，这反过来阻碍线粒体生物发生（图5F-5H）。另外与健康对照组相比，DMD hiPSC-CMs中凋亡标记物caspase-3和cleaved PARP增加，β-半乳糖苷酶信号积累增加。当从第20天开始每天使用布雷他汀（blebbistatin）阻断DMD hiPSC-CM收缩，通过控制剂量将肌球蛋白头部锁定在低亲和力状态，从而防止actin结合，发现端粒缩短终止了，第30天测量确定确实如此（图5I）。表明shelterin基因下调伴随着由于异常收缩导致的非细胞分裂的端粒缩短，引起p53依赖的DNA损伤应答。

图5 DMD hiPSC-CMs中p53上调。（A）p53激活的western图像。（B）DNA损伤53BP1 foci的免疫荧光图像。（C）心脏troponin T阳性hiPSC-CMs中的p21。（D, E）p21定量。（F）qRT-PCR测得PGC-1α（线粒体生物发生的主要调节因子）表达减少。（G）MitoTracker Green和qRT-PCR测得的线粒体数量。（H）线粒体拷贝数量。（I）第20-30天使用布雷他汀抑制DMD hiPSC-CMs收缩时，可阻止端粒丢失。

结论

       本研究证明了在含结构蛋白dystrophin突变的hiPSC源心肌细胞中，端粒会通过一种复制非依赖性机制进行性缩短。已知DMD小鼠模型（mdx4cv）中端粒长度的人源化可以显露出扩张型心肌病表型，在Noth单倍体不足（Notch+/-）小鼠中科显露双尖瓣表型。使用DMD hiPSC疾病模型能够绘制端粒缩短的动态图，证实并扩展了在鼠和人心脏组织中观察到的致病过程。

       文中的DMD hiPSC-CM模型和牵引力显微镜在硬水凝胶上的应用如实地概括了DMD患者心肌病的特征。不仅探究了DMD心肌纤维化发展后期，硬度增加损害DMD hiPSC-CMs收缩功能的机制，还表明心肌细胞可以补偿健康心脏中dystrophin的缺乏，但无法补偿僵硬、纤维化的心脏，这可以解释为什么DMD患者随着年龄的增长越来越容易患心律失常和心力衰竭。对不同硬度微环境的收缩反应的特征表明，DMD心肌细胞急性机械功能障碍的发展与心脏纤维化进展是同步的。

       端粒缩短的分子触发因素可能是shelterin复合物的丢失。研究发现DMD心肌细胞中，shelterin复合物与端粒的结合在非增殖性端粒缩短开始时减少，这可能是由于缺乏dystrophin时的收缩应激。鉴于DMD hiPSC-CMs中ROS产生增加约30%，且已知高ROS可以驱动端粒氧化并破坏shelterin结合，因此可推测未被覆盖的端粒重复序列的直接氧化也可能参与端粒缩短。虽然研究表明shelterin在DMD hiPSC-CMs中的表达降低，但仍有待确定shelterin表达的丧失是DMD心肌细胞端粒去保护的原因还是结果。此外，ROS的产生部分由DMD心肌细胞收缩活动驱动。研究发现布雷他汀阻碍端粒缩短，表明收缩功能至关重要，但这是否是由于ROS介导的端粒去保护或肌节组织破坏仍有待阐明。尽管如此，这些数据仍支持收缩与关键结构收缩蛋白的遗传缺失是端粒缩短的主要原因。另外DMD hiPSC-CMs中结构完整性的丧失可能会引发转录变化，下游后遗症包括激活DNA损伤应答（53BP1、p53和p21蛋白积累）、线粒体死亡和代谢衰竭，与mTRG4小鼠衰老模型和DMD小鼠“人源化”端粒模型（mdx4cv/mTRG2）一致。

       DMD hiPSC-CMs获得“衰老样状态”是由于53BP1、p53、p21和β-半乳糖苷酶的表达。虽然端粒长度在心肌病发病机制中非常关键，但DNA损伤应答可能会破坏对细胞存活重要的其他途径，如抑制线粒体生物发生相关的PGC-1α。

       总之，研究表明营养不良的心肌细胞中，端粒缩短的发生与增殖无关，并且可能由收缩诱导的ROS驱动。这提出了一个治疗靶点，端粒维持，对改善或阻止DMD心肌病进展有很大推进作用。

参考文献：

Chang,  Alex C. Y. , et al. "Increased tissue stiffness triggers contractile  dysfunction and telomere shortening in dystrophic cardiomyocytes."  (2021).