细胞可根据其局部微环境改变机械特性，这与决定细胞功能有关，甚至可以影响干细胞情况。美国研究人员Ming Guo等确定了细胞硬度和细胞体积之间具有稳定且统一的关系。当细胞在基质上铺展时，它的体积减小，而硬度随之增加。细胞皮质和胞质硬度会因各种扰动而随体积变化，包括不同的基质硬度、细胞铺展面积和外部渗透压变化。细胞体积减少是水流出的结果，这也导致细胞内分子拥挤程度相应增加。此外，细胞体积变化进而硬度变化会改变干细胞分化。这些结果揭示了细胞硬度和细胞体积间不可思议的关系，对细胞生物学具有深远影响。文章以“Cell volume change through water efflux impacts cell stiffness and stemcell fate”为题发表于PNAS。

背景

       细胞体积是一个高度受调控的特性，它会影响无数功能，会随着细胞生命循环发生改变，会随着细胞质膜生长、蛋白、DNA及其它包内物质的增加而增加。当细胞通过有限空间迁移时，细胞体积也会发生快速变化，此时体积变化是水运输到胞外实现的。而这种快速变化会导致胞内物质及分子拥挤，从而产生诸多严重影响。通过施加外部渗透压可迫使水流出细胞，直接使细胞体积减少，导致胞内物质浓度增加，分子拥挤度增加。此外还会改变细胞力学，导致硬度增加、影响蛋白折叠和运输以及染色质凝聚。这种渗透压引发的体积变化对细胞行为产生的巨大影响促生了一个问题，即等渗情况下，细胞是否会通过水外流改变体积，通过改变分子拥挤度来调节力学及行为。

       本研究证明了当细胞培养于相同的等渗条件时，如胞外环境较硬，细胞会通过水外流减少细胞体积，这对细胞力学和细胞生理有巨大影响。当一个细胞在坚硬基质上铺展开时，它体积减少，细胞行为与施加了外部渗透压的细胞类似，即随着细胞体积减小，皮质和胞质硬度增加，而细胞核体积也随细胞体积减小而减小。此外干细胞分化受细胞体积变化的影响也很强烈。这些结果表明不同环境下的细胞可通过水外流来改变体积，引发胞内分子拥挤度变化并影响细胞力学、生理及行为，对细胞命运产生深远影响。

结果

01-施加外部渗透压情况下，细胞体积模量和剪切模量随细胞体积减小而增加

       通过添加300Da聚乙二醇（PEG300）控制外部渗透压，直接探索细胞体积变化的后果。荧光标记细胞质和细胞表面测量细胞体积，共聚焦显微镜以3D模式识别细胞边界。细胞饥饿一夜后成像以消除自然细胞周期变化影响。测量体积与已有原子力显微镜（AFM）测量体积一致。同一样品将共聚焦测量结果与高分辨率结构光照明显微术（SIM）测量结果比较，作进一步验证。两种技术测得的细胞体积一致，表明测量不确定度< 10%（图S1）。

       为探索细胞体积对外部渗透压的依赖性，在玻璃基底上培养A7细胞，并向培养基中加入浓度逐渐增加的PEG 300，由于PEG 300不穿透细胞膜，因此实现外部渗透压增加。由于渗透压对细胞皮质平衡的影响可以忽略不计，而胞内渗透压由离子和小蛋白质的浓度控制。因此为了补偿外部渗透压的增加，细胞必须通过离子流入或水流出来增加其内部渗透物浓度。研究发现细胞体积随着外部渗透压的增加而减少（图S2），去除外部渗透压后细胞体积恢复到原始值，因此这是水流出引起的。细胞在jiduan渗透压下最终可达最小体积（图S2）；这反映了胞内总物质以及水合离子和蛋白质所需的渗透惰性水的总体积。排除体积的理想气体系统中，渗透压P和细胞体积V之间的关系符合P = NkBT/(V-Vmin)，其中N是细胞内渗透物数量，kB是玻尔兹曼常数，T是juedui温度，Vmin是最小体积。考马斯亮蓝测量渗透压缩前后每个细胞的总蛋白含量，发现没有显著差异，证实细胞体积的减少是水流出所致。

       随着细胞体积的减少，胞内离子和其他物质浓度增加，去除额外的水并进一步缩小细胞越来越困难。水离开细胞的阻力是渗透体积模量，定义为B = -VdP/dV ~ -VΔP/ΔV。通过改变渗透压并测量玻璃基底培养的A7细胞的总体积得到B，发现它随细胞体积的减少而增加（图1A）。利用P对体积的依赖性，可预测体积模量即B = NkBTV/(V-Vmin)2。该函数形式与数据匹配jihao（图1A虚线）。拟合确定的Vmin值为2,053 ± 30 μm3，与jiduan渗透压下去除所有渗透活性水时测得的细胞最小体积（约2,100 μm3）一致。拟合还提供了N值，得到浓度约200 mM，与细胞内已知的盐浓度一致。表明渗透压存在情况下，离子和蛋白质的总量保持近似恒定。虽然渗透压平衡很大程度上受离子浓度控制，但随着游离水离开细胞，大蛋白质和细胞器的浓度也会增加。正是这些蛋白质和细胞器（包括细胞核）的体积决定了Vmin。此外，随着细胞接近其最小体积，胞内分子拥挤程度必然增加，而这可能导致细胞行为发生其他变化。

       诸多细胞特性中，细胞皮质硬度在渗透压存在时受分子拥挤度影响会随体积变化。使用光学磁性仪（OMTC）测定A7细胞的皮质剪切模量G，从而确定皮质硬度变化（图S3）。OMTC测得结果与已有AFM结果在数量上一致。随着外部渗透压增加，皮质剪切模量和体积都快速且同时变化（图1B）。去除外部渗透压后，皮质剪切模量立即恢复至初始值（图S2B）。细胞皮质硬度与体积模量趋势相同，可*用相同函数描述（图1A）。拟合得到的Vmin值为2,004 ± 41 μm3，与体积模量得到的值非常一致。但剪切模量的值始终比体积模量小三个数量级。这种相似性意味着分子拥挤对两者都有显著影响。

       细胞剪切模量的主要源于皮层硬度。但细胞结构呈高度异质性，内部要柔软得多；细胞的细胞质是弱弹性凝胶，其剪切模量比皮层的低三个数量级。为了测量细胞质的硬度，将PEG包被的聚苯乙烯珠微注射到A7细胞中，激光镊子确定胞质剪切模量（图S3）。发现胞内剪切模量随细胞体积减少而增加，遵循与皮质剪切模量和体积模量相同的趋势（图1A）。随着细胞体积进一步减小，细胞质剪切模量明显增加，但值太大无法用激光镊子测量。在可及的范围内，胞质剪切模量与其它两个模量函数形式相同（图1A底部虚线），但比皮质剪切模量的值小三个数量级。

图1 玻璃上生长的A7细胞的机械特性与细胞体积在外部渗透压下的函数。（A）渗透体积模量（灰色三角）、皮质剪切模量（红色三角）和胞质剪切模量（空心三角）随细胞体积减少而增加。穿过灰色三角的虚线表函数B = NkBTV/(V-Vmin)2 (R2 = 0.99)的最小二乘拟合。穿过皮质和胞质模量的虚线拟合*相同，分别缩放500和100,000倍。（B）OMTC测量的单个A7细胞的皮质剪切模量，施加0.26 M PEG 300渗透压后立即增加，与细胞体积减少同时发生。

02-当在较硬的基质上培养时，细胞体积减小

       皮质硬度是细胞力学的一个关键物理特性，通常随着细胞生长基质硬度的降低而降低。即使在等渗条件下细胞形态也可随基质硬度显著变化。在涂有Ⅰ型胶原的100μm聚丙烯酰胺（PA）凝胶上培养A7细胞，通过改变凝胶成分使其剪切模量可在0.1-10 kPa变化，与自然组织的生理弹性相匹配（表S1）。测量细胞铺展面积，已知较硬基质上培养的细胞铺展面积显著增加（图2A上，图2B）。然而结果发现细胞体积并不守恒，随着基质硬度增加，细胞体积减少。在最坚硬基质上生长的细胞的体积较最柔软基质上减少约40%（图2C）。其他哺乳动物细胞型，包括HeLa、NIH 3T3、小鼠间充质干细胞（mMSCs）和原代人气道平滑肌细胞（HASM）表现出类似的行为（图2C）。证实细胞体积依赖于基质硬度具有普遍性。因此，即使外部渗透压不变，细胞体积也会改变。

图2 粘附细胞的形态和体积随基质硬度的增加而改变。（A）A7细胞的俯视图和侧视图，分别固定于涂有Ⅰ型胶原的硬（剪切模量10kPa）和软（剪切模量1200Pa）PA凝胶基质上。肌动蛋白皮质（绿色），细胞核（蓝色）。（B）细胞面积随基质硬度增加而增加。（C）细胞体积随基质硬度增加而显著减小。

03-限制细胞铺展面积会使细胞体积增大

       在玻璃基底上培养A7细胞，微绘制不同大小的胶原“岛”以限制细胞的粘附面积。发现与铺展面积不受限制的细胞相比，铺展面积受限的细胞高度更高（图3A）。此外细胞体积也随铺展面积的减少而增加（图3B）。在较软基底上培养时观察到同样效果，即如果细胞铺展面积受限小于该基底自由铺展面积，则细胞体积增加。不同粘附面积或不同基底硬度都是如此（图3C蓝色和灰色点）。

04-细胞体积减少是细胞内水流出所致

       监测一个yidanbaimei化细胞在硬基质上的铺展情况，以确定等渗条件下细胞体积减少是由于蛋白质含量变化还是由于水的流出。细胞在约20min内从最初的圆形变为*铺展开状态。在此期间，细胞体积随着展开面积增加而减少（图3D）。不同受限区域、不同硬度基质上，体积和展开面积间的关系相同（图3C红色×）。水可以在一分钟内离开细胞，而哺乳动物细胞因生长而产生的胞内物质数量变化通常需要几个小时。因此等渗条件下的体积减少zuiyou可能是通过水交换来控制的。

       测量硬基质和软基质上培养细胞每细胞的总蛋白质含量，发现没有显著差异。用纯PEG置换培养基对细胞施加jiduan渗透压，从细胞中提取所有渗透活性水，发现所得最小体积Vmin与基质硬度无关（图4）。由于Vmin可大致反映胞内物质和渗透不活跃的结合水的量，因此细胞体积的变化是由胞内游离水的交换引起的。

图3 A7细胞体积随细胞铺展面积减少而增加。（A）玻璃上不同大小微岛上A7细胞的3D图像。（B）随着玻璃上细胞铺展面积增加，细胞体积减少。（C）不同硬度基质上，细胞体积与投影面积的函数（灰色圆圈；n > 200）。（D）单个细胞在硬基质上动态附着时细胞铺展面积和体积的变化（n = 3）。（E）细胞体积因水流出而减少的示意图。

05-细胞铺展过程中，离子通道和肌动球蛋白细胞骨架与细胞体积减少有关

       等渗条件下细胞铺展时的水流出与渗透压存在时的水流出原因不同。细胞铺展过程中，细胞体积要在等渗条件下减少，为了让水离开细胞，渗透物的总量必须改变。由于每个细胞的蛋白量保持不变，那么可能是与周围环境发生了离子交换。已知细胞铺展过程中细胞骨架张力增加，而这与离子通道活性增加有关。因此在细胞*铺展后使用0.1mM NPPB抑制氯离子通道。当离子通道被阻断，随着基质硬度增加，细胞体积的减少受到显著抑制（图4B绿色空心三角）。表明等渗条件下细胞体积的减少需要离子通道活性，通过改变内部渗透物的总量来实现。

       为进一步测试活跃的细胞过程是否会影响细胞体积变化，用10μM 布雷他汀（blebbistatin）处理细胞以抑制肌球蛋白II运动活性，直接降低细胞骨架张力。发现布雷他汀处理阻碍了细胞在硬基质上的体积减少（图4B蓝色三角）。使用2 mM NaN3和10mM 2-deoxyglucose消耗ATP抑制一般运动同样观察到类似效果（图4B粉红色三角）。进一步证明等渗条件下，活跃的细胞过程与体积减少有关，细胞必须使用离子通道主动控制渗透物浓度，以影响水的流出并改变体积。

图4 药物处理和渗透压下的细胞形态和体积。（A）对照细胞和ATP耗竭细胞在jiduan渗透压下，硬基质和软基质上的三维形态。细胞质（绿色），细胞核（黄色）。（B）无主动收缩（布雷他汀处理和ATP耗竭）且处于极度渗透压下的细胞，体积与基质硬度不呈依赖性；氯离子通道被抑制（NPPB处理）的细胞，体积对基质硬度的依赖性较弱。对照细胞同图2C。

06-细胞模量对细胞体积有普遍依赖性

       等渗条件下细胞铺展面积变大，细胞皮质硬度随基质硬度增加而增加，当固定基质硬度改变铺展面积时，细胞皮质硬度也会增加。当基质硬度和铺展面积固定时，渗透压增加细胞硬度也增加，细胞体积减小。因此，假设细胞体积变化是所有这些情况下观察到的细胞硬度变化的共同描述因子。将皮质硬度绘制为体积的函数，即在较软基质上生长时，细胞硬度随体积的增加而降低（图5A）。当在固定硬度、不同粘附面积的基质上生长时，细胞硬度以类似的方式随体积增加而降低（图5B）。当生长在软基质上并被有外部渗透压时（图5C），以及生长在坚硬且铺展面积高度受限基质上有渗透压时（图5D），细胞硬度增加。将所有数据绘制在一张图表上（图5E），数据出现重叠并且细胞硬度与细胞体积之间表现出普遍相关性。因此细胞硬度变化可用细胞体积来描述。本文数据都是由单一细胞类型A7获得的，其他细胞类型中尽管振幅和体积上有所偏移，但也观察到类似的情况（图S4）。

       拆分数据，在不施加外部渗透压情况下，细胞只对基质硬度或铺展面积的变化做出反应，符合G ∝ 1/V2（图5E实线）。如果包括所有数据，完整行为符合G∝kBTV/(V-Vmin)2（图5E虚线）。虽然没有模型预测剪切模量的行为，但它在函数形式上与相同体积范围内的体积模量行为相同，即B∝kBTV/(V-Vmin)2，通过测量细胞P-V关系得到，反映了当水从细胞中抽出时分子拥挤程度增加带来的影响。因此类似的拥挤现象也是皮质剪切模量变化的原因。此外多重扰动下渗透体积模量和细胞质剪切模量都普遍依赖于细胞体积（图S5），与图1A所示的渗透压情况下一样。

       添加布雷他汀抑制肌动球蛋白收缩的数据以探索细胞硬度和细胞体积之间相关性的普遍性，发现皮质硬度与体积还是*相同的函数曲线（图5E青色五边形）。当ATP*耗尽时，数据趋势相同（图5E黑色三角形）。不仅是分离的细胞，2D细胞单层中也观察到类似行为。将上皮MCF10-A细胞生长为密度不同的单层，测量相应的细胞体积和皮质剪切模量，发现细胞体积随细胞密度的增加而减少（图S4B）。细胞体积和硬度依旧存在相关，即随着细胞密度增加，细胞体积减少，皮质硬度增加，符合1/V2。这些结果意味着细胞体积参与决定细胞力学。

图5 细胞皮质硬度与细胞体积的关系。（A-D）不同条件下，A7细胞的细胞皮质剪切模量对细胞体积的依赖性，包括不同硬度基质（A），不同大小微图案的硬基质（B），剪切模量100Pa的软基质并施加逐渐增加的渗透压（C），玻璃基质上微图案限制细胞铺展并施加渗透压（D）。（E）细胞皮质剪切模量与细胞体积成比例，图示为细胞生长在不同硬度基质上（灰色圆圈），微图案限制有效铺展面积的玻璃基质上（蓝色方块），有渗透压的软基质上（剪切模量100Pa，绿色倒置三角形），未图案化有渗透压玻璃基质（红色三角形），图案化有渗透压玻璃基质（黄色菱形），10μM布雷他汀处理（青色五边形）或ATP耗尽（黑色三角形）的玻璃基质。实线表示数据的幂律拟合。虚线表示符合G∝kBTV/(V-Vmin)2。

07-细胞核体积跟随细胞体积变化

       核膜像细胞膜一样，是选择性渗透的，允许水交换。因此需要探究细胞流出的水是否也来自细胞核。用荧光标记细胞核，3D共聚焦显微镜测量核体积。发现细胞核体积随细胞体积变化，不同基质、等渗条件下生长的细胞如此，体积因外部渗透压而改变的细胞也是如此（图6）。表明随着细胞体积的减少，细胞核也变得更加拥挤，这对细胞核内的运动程度有直接影响。测量了GFP标记的组蛋白H2B的波动运动。计算均方位移，发现当外部渗透压使分子拥挤增加时，波动水平显著降低（图6B）。

图6 细胞核体积及核动力学随细胞体积的变化。（A）细胞核体积一般随细胞体积变化，减少程度与基质硬度、铺展面积、渗透压力的增加成比例，测试的各细胞型中核体积与细胞体积间的比率近似恒定。（B）MCF-10A细胞核中GFP标记组蛋白的均方图，反映染色质位置波动，0.1 M PEG300jiduan渗透压情况下显著减少。

08-细胞体积改变可调控干细胞命运

       由于细胞体积与细胞硬度以及分子拥挤等其他参数有内在联系，因此需要探究细胞体积对干细胞分化的影响。通过渗透压从外部施压使细胞体积变化，这会导致细胞硬度变化，但铺展面积和基质特性没有变化，也不会改变细胞内的张力（图S6）。在两种不同PA凝胶基质上生长mMSC，分别为剪切模量7kPa的硬基质和剪切模量0.2kPa的软基质。软基质上的细胞体积通常较大，用0.1 M PEG 300（+100 mOsm）施加额外渗透压使两种凝胶上的细胞体积相匹配（图7 D和E）。当体积匹配时，细胞硬度也匹配（图7F）。将细胞置于支持成骨和成脂命运的双潜能分化培养基中培养1周后，通过碱性磷酸酶（ALP）活性观察。可见与软基质上未受干扰的细胞相比，坚硬基质上成骨分化显著增加。软基质+渗透压也表现出ALP活性增强，表明优先成骨分化（图7 A和B）。Western分析成骨生物标记物runt相关转录因子2（RUNX2）和骨唾液蛋白（BSP）表达证实了这一点。

       使用低渗条件（-80 mOsm）使硬基质上的细胞膨胀，使细胞体积和细胞核体积与软基质上的细胞相匹配（图7 J和K）。当体积匹配时，细胞硬度也匹配（图7L）。通过油红O（ORO）原位染色中性脂质堆积，成脂生物标志物PPAR-γ表达（图7G-I）可观察到大量成脂分化。表明可以通过改变干细胞的体积来影响其向成骨或成脂方向的分化，核内或细胞内拥挤会影响干细胞命运。

09-干细胞命运影响细胞体积

       在缺乏强化学信号的情况下，基质硬度或外部渗透压等物理特性会影响干细胞的分化。但化学信号通常可以超越这些物理信号。在柔软的PA凝胶上培养mMSCs（偏向成脂分化），向培养基中加入补充剂（β-磷酸甘油、抗坏血酸和Dexamethasone）诱导细胞向成骨方向分化。结果发现mMSCs进行成骨分化，且该过程中细胞体积减小，甚至成骨分化前就已经减小（图7M）。对硬基质上的mMSCs用Dexamethasone单独化学诱导成脂，细胞体积增加（图7N）。表明细胞体积和干细胞分化密切相关。

图7 细胞体积影响mMSCs分化。（A-F）成骨分化。（A）成骨和成脂组合诱导下mMSC培养1周后，原位染色ALP（黑色）核细胞（DAPI，蓝色），发现有渗透压时，硬基质（剪切模量7kPa）和软基质（剪切模量100Pa）上成骨分化增加。（B）mMSC成骨分化的平均百分比。（C）mMSCs培养3天后Western分析成骨蛋白表达。（C-F）共聚焦核OMTC测得的细胞体积（D）、核体积（E）、皮质剪切模量（F）。（G-L）成脂分化。（G）组合培养2周后原位染色脂滴（红色），发现低渗透压力下（30% DI水），硬基质上成脂分化增加。（H）成脂分化平均百分比。（I）培养1周后Western检测成脂蛋白表达（PPAR-γ）。（J-L）共聚焦核OMTC测得的细胞体积（H）、核体积（K）、皮质剪切模量（L）。（M）mMSCs成骨培养培养10天后，Fast Blue染色测量表达高水平ALP的细胞的比率。随着分化细胞比率增加，细胞体积相应减少。（N）mMSCs成脂培养基培养2周后，ORO染色测量有明显脂滴聚集的细胞比率。随着分化细胞比率增加，细胞体积响应增加。

讨论

       本研究数据确立了细胞体积和分子拥挤程度在决定细胞特性（包括细胞硬度和细胞内动力学）中的关键重要性。证明了细胞体积变化可与细胞内含水量变化直接相关，蛋白和其他物质的水平保持不变：当底物硬度或细胞铺展面积增加时，细胞通过降低其含水量并因此增加其硬度来作出反应。虽然肌动球蛋白的收缩性对这种适应是bibukeshao的，但细胞骨架产生的应力太弱（约1-10kPa，图S6），因此细胞骨架力无法将水分挤出细胞。

       zuiyou可能的是细胞骨架的收缩张力增加了离子通道的活性，这反过来又影响细胞间的含水量，从而影响细胞体积。这与本文发现一致，即抑制特定离子通道和ATP依赖性过程的活性时，细胞体积的变化受到抑制。皮质剪切模量和细胞体积模量的函数形式与细胞体积*相同（图S5）。体积模量行为可以理解为分子拥挤的结果，但皮质剪切模量行为的潜在机制尚不清楚。

       另外蛋白质浓度变化对细胞生理有重要影响，典型的表现是细胞体积变化对干细胞分化的影响。细胞内含水量的变化会改变细胞内分子拥挤度和细胞动力学（图6和图S7）。这无疑会使许多内部生理过程发生显著变化，如蛋白质折叠和结合动力学、结构重排和转运现象以及蛋白表达模式。此外，由于细胞核的体积随着细胞体积的减少而减少，类似的效应也会延伸到细胞核中（图6A），引发核内分子拥挤度改变，并可能影响层粘连蛋白浓度，从而影响染色质结构、流动性，影响转录和基因表达模式。因此细胞体积和细胞核体积可以在生理条件下改变，如组织压缩和体内渗透变化，进而影响无数的细胞过程，如信号传导、蛋白质动力学，甚至干细胞分化。

参考文献：

Guo  M , Pegoraro A F , Mao A , et al. Cell volume change through water  efflux impacts cell stiffness and stem cell fate[J]. Proceedings of the  National Academy of Sciences, 2017, 114(41):201705179.