ChIP-seq组蛋白特异性修饰位点应用

1. Input和IP样本之间的关系是什么？
Input和IP属于两个样本，在前期检测、建库、测序都是平行进行的，但是分析中需要将两个样本的测序数据进行整合分析，得出终的peak结果，并进行后续分析。

2. Input是什么？有什么作用？
我们将DNA或者RNA fragmentation后，在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照（不进行免疫沉淀过程）。Input是断裂后的基因组DNA或者RNA，需要与沉淀后的样品DNA/RNA一起经过逆转交联，DNA/RNA纯化，以及后的PCR或其他方法检测。通过后续数据分析，我们可以通过Input对照排除背景噪音（排除因本底表达水平高或一些非特异性结合所造成的假阳性peaks），验证染色质断裂的效果和整个实验中IP效果，所以Input对照是IP-seq实验*的步骤。

3. 阳性对照和阴性对照是什么？
阳性对照

一般用anti-RNA polymerase II抗体，因为RNA polymerase II是通用转录因子，在所有细胞中都能结合基因的核心启动子区，因此理论上，ChIP后PCR会有条带。一般阳性对照不进行测序。

阴性对照

阴性对照分为mock和Input两种，二者均能起到减少假阳性的作用。mock：用普通IgG为抗体，理论上不会ChIP下来任何DNA fragment，因此作为阴性对照，但是由于非特异性结合，或者实验过程，没发生结合的DNA清楚不*，可能会出现条带，但是一般条带亮度较弱。IgG不需要进行测序，只是判断IP试验中所选取的抗体是否特异。

4. ChIP-seq的推荐测序数据量是多少？是否需要设置重复？

一般来说，ChIP得到的DNA fragment丰富度较低，大数据量测序意义不大。按照ENCODE目前标准：转录因子建议有20 M以上的可用reads；不同组蛋白标准不一，基本在20 M-45 M可用reads。

ChIP-seq的实验过程较为复杂，早期文章中往往缺少重复样本的设置。不过为了提高文章结论的可信度，目前的分析标准中通常推荐有2个以上的生物学重复；对于样本较难获得的情况，可以不设置生物学重复。

5. ChIP实验中使用的对照样本是否也需要测序？需要哪些对照？

ChIP富集中常见的对照包括：

1）input，片段化后未经抗体富集的染色质后期去蛋白得到的DNA；

2）阳性对照，利用普通组蛋白或RNA聚合酶等阳性蛋白抗体进行免疫沉淀得到的DNA；

3）阴性对照，免疫沉淀过程中不加入抗体或者加入非特异性IgG抗体得到的DNA。

其中，input在数据分析时用于除去背景、进行检峰，是必须要进行建库测序的样本；阳性对照所用抗体与目标蛋白无关，不必进行建库测序；阴性对照理论上基本不会捕获到足量DNA，无法进行建库测序。

ChIP-seq组蛋白特异性修饰位点应用

?相关技术服务：

1、 DNA亲和纯化测序（DAP-seq）：高通量检测转录因子或DAN结合蛋白在基因组上的结合位点。

2、 酵母单杂交：DAP-seq后续验证服务。

3、 EMSA：验证蛋白和DNA是否结合，可用于DAP-seq的后续验证。

4、 DAP-seq与RNA-seq联合分析： 分析转录因子的靶基因在RNA-seq数据中的表达变化，深入挖掘DAP-seq和RNA-seq测序数据，增加转录组测序的分析深度。

5、 DNA-pull down：鉴定与DNA结合的蛋白。

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