蛋白层析柱一般用于纯化蛋白质和核酸等大分子物质的方法的主要依据是各种大分子物质之间理化特性的差异性。亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法。亲和层析柱一般很短，通常10cm左右。上样时应注意选择适当的条件，包括上样流速、缓冲液种类、pH、离子强度、温度等，以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。

 

　　生物大分子和配体之间达到平衡的速度很慢，所以样品液的浓度不易过高，上样时流速应比较慢，以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。当配体和待分离的生物大分子的亲和力比较小或样品浓度较高、杂质较多时，可以在上样后停止流动，让样品在层析柱中反应一段时间，或者将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量。

 

　　样品缓冲液的选择也是要使待分离的生物大分子与配体有较强的亲和力。另外样品缓冲液中一般有一定的的离子强度，以减小基质、配体与样品其它组分之间的非特异性吸附。

 

　　层析柱的柱效测定是在纯化实验中非常重要的步骤，也是我们得到准确结果的保证。如果您是自己装柱，建议您在使用前先做柱效测定来确定柱子的效果。另外，当层析柱使用过一定次数，或者发生实验结果异常，柱子进入气泡，超压等问题，我们也可以对柱子进行柱效测定来判断柱效是否正常。

 

　　蛋白层析柱的柱效测定标准：

 

　　柱效测定主要通过计算理论踏板高度（HETP）和对称性（As）来确定，Pulsetest是目前常用的测试方法，即使用少量的样品流经装填好的层析柱中，通过仪器上的检测器检测实验过程，实验结束后对洗脱峰进行分析。