辽宁省《水质 DNA条形码鉴定底栖动物》征求意见
- 2021/10/19 10:12:21 24452
- 来源：仪表网
【仪表网 仪表标准】为进一步完善辽宁省生态环境监测技术体系，更好地发挥生态环境监测对环境管理的技术支撑作用，辽宁省生态环境厅组织开展了《水质 DNA条形码鉴定底栖动物》编制工作，目前起草单位已经完成标准征求意见稿及编制说明。根据辽宁省地方标准制修订工作管理的有关规定，现面向社会公开征求意见。
DNA条形码技术自提出以来，在动物物种鉴定方面取得了良好成果，如鸟类、鱼类、昆虫、哺乳类、两栖类、兽类、浮游和海洋小型底栖动物等。2004年以来，生命条形码联盟(the Consortium for the Barcode of Life，CBOL)在美国华盛顿建立，已有超过45个国家的120多个组织参与其中。国际生命条形码计划(International Barcoding of Life, iBOL)也已于2010年开展实施。
近年来环境DNA(Enviromental DNA, eDNA)技术作为DNA条形码技术的最新进展日趋火热，eDNA技术起源于微生物领域，最早被用于分离纯化环境中微生物的DNA，随后逐渐被应用于植物群落多样性等领域，主要用于测定空气中的植物孢子，后来才被用于监测水生生物(王学昉，2021)。我国首届环境DNA与生态健康评估学术研讨会也于2019年9月7日在南京大学召开，标志着我国环境监测领域向着eDNA技术与水生态监测相结合迈出了重要一步。但eDNA受制于pH、温度、光照、流速、水深等自然因素、非目标水样的外界污染以及一些技术因素的影响，其目前在水生态监测领域尚有其局限性。
目前，国内外基于DNA条形码的相关科研成果众多，但标准较少，国内标准仅在《家畜家禽成分 DNA 条形码检测技术规范》(SN/T 5199-2020)和《中国药典(2020年版)》中“9107 中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”等标准对家畜和家禽和中药材的鉴定规定了DNA条形码的方法，底栖动物的分类鉴定尚无标准或规范。
为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护环境，增强底栖动物监测工作的科学性、针对性和有效性，制定本标准。
本标准按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本标准规定了通过DNA条形码方法鉴定底栖动物。
方法原理：
使用苯酚-氯仿法提取底栖动物总DNA，SDS作为细胞裂解液先裂解细胞，通过苯酚和氯仿的反复抽提，使蛋白质等杂质留在有机相，DNA留在水相，进而分离得到总DNA。PCR反应可特异性的扩增正向引物和反向引物间的序列，经35次循环，目标COI序列可被扩增235倍。与DNA结合的EB会被紫外光激发发出强烈的橙红色荧光，与未结合的EB相比，荧光强度高几十倍，从而扩增的COI序列可被检测到。获得的COI序列经测序在NCBI或BOLD等公共数据库中搜索相似序列。将测序结果与搜索得到的序列一起绘制NJ进化树并计算遗传距离，一般遗传距离小于2%的认为是同一种。
仪器和设备：
(1)天平：赛多利斯PB-10，准确到0.001g。
(2)干式恒温器：杭州瑞诚DH-300，56℃可调。
(3)PCR仪：威泰克SEDI-G
(4)水平电泳仪：HoeferPS300-B，电压100V可调。
(5)离心机：湖南湘仪H1650-W，12000r/min可调。
(6)凝胶成像仪：SYNGENE GBOX-F3。
(7)制冰机：常熟圣海冰知雪IMS-85。
(8)移液器：Eppendorf，2.5μl、10μl、100μl、200μl、1ml。
(9)一般实验室常用仪器和设备。
分析步骤：
总DNA的提取：
总DNA的提取采用上海生工的Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒。提取步骤为：
①取约25mg动物组织，加入180μl ACL，20μl蛋白酶K，56℃温浴1-4h；
②加入200μl CL，200μl无水乙醇，混匀；
③放入吸附柱，静置2min，10000rpm离心1min，弃废液；
④加入500μl CW1，10000rpm离心30s，弃废液；
⑤加入500μl CW2，10000rpm离心30s，齐废液；
⑥12000rpm离心2min，去残留的CW2，开盖静置数分钟；
⑦加入100μl CE，静置3min，12000rpm离心2min，收集DNA。重复一次该步骤，最终收集得到200μl总DNA。
质量保证与质量控制：
实验前的鉴定及拍照：
每次实验前应先对物种进行目或科的简单分类鉴定，并拍照记录，若测试结果与实验前鉴定完全不同，则需查找原因并重新测试。
平行样的测定：
每次实验需开展平行双样测试，两次鉴定结果需完全相同，否则应查找原因并重新测试。
注意事项：
EB具有毒性，实验室内应划分清洁区与EB污染区。实验时应带好手套等防护措施，若沾染EB后应使用大量清水清洗。
本标准适用于辽宁省内河流中底栖动物的鉴定。
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