《柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR检测技术规程》征求意见
- 2023/12/22 13:31:16 29512
- 来源：仪表网
【仪表网 行业标准】近日，由全国农业技术推广服务中心 、华南农业大学 、中国农业科学院柑桔研究所等单位起草，TC271(全国植物检疫标准化技术委员会)归口的国家标准计划《柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR检测技术规程》征求意见稿已编制完成，现公开征求意见。
柑橘黄龙病是柑橘生产上最具毁灭性病害，柑橘黄龙病的检疫检验是黄龙病防控的重要组成部分，是阻断黄龙病传播的有效途径和重要手段。为规范柑橘黄龙病检疫检验程序，农业部于2011年制定了《柑桔黄龙病菌实时荧光 PCR 检测方法》(GB 28062-2011)。距该标准制定已过去11年，随着柑橘黄龙病菌基因组的测序与公布，在黄龙病菌的PCR检测上发现了更为特异且灵敏的检测引物，可进一步优化黄龙病PCR检测的准确性与灵敏性。因此，有必要对《柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法》进行修订重新发布。
本标准包括范围、规范性引用文件、术语和定义、柑橘黄龙病基本信息、方法原理、实验室设置、主要仪器设备和试剂、取样及样品处理、PCR 扩增、结果判定与表述以及附录11个部分。
本次修订在《柑桔黄龙病菌实时荧光 PCR 检测方法》(GB 28062-2011)的基础上进行了调整，主要有以下8个方面。
1. 全文将“柑桔”修改为“柑橘”。
2. 在范围部分，将“柑桔黄龙病亚洲韧皮部杆菌”修改为“柑橘黄龙病病原韧皮部杆菌亚洲种”。修改“黄龙病亚洲韧皮部杆菌”为“韧皮部杆菌亚洲种”。
3. 在柑橘黄龙病基本信息部分，修改“亚洲韧皮杆菌”为“韧皮部杆菌亚洲种”，修改“非洲韧皮杆菌”为“韧皮部杆菌非洲种”，修改“美洲韧皮杆菌”为“韧皮部杆菌美洲种”。
4. 在取样方法部分。对叶片样品的采集根据症状进行区分采样，修改为“疑似病树优先采集疑似斑驳黄化症状的叶片，如无典型症状，按树冠东南西北四方采集，每点取上中下部叶片各1片，每棵树共采集叶片12张。”果实样品中增加“橘络”组织样本。便于植物检疫人员能更准确地采集疑似黄龙病相关的样品，从而提高检测的有效性。
5. 在结果判定与表述部分。在质控标准中，阳性对照的 Ct值从“应<28.0”修改为“应≤30.0”。对特殊情况样本的判断中建议“用在基因组中有 5 个拷贝的核苷酸还原酶基因引物进行实时荧光 PCR 复测”，以进一步提高检测的准确性。
6. 在附录 D 柑桔黄龙病的症状鉴定部分，替换了部分黄龙病的症状图片，删除柑橘木虱模型图替换为实物图，同时补充对柑橘木虱的详细描述，以便于植物检疫人员能更准确地采集黄龙病及柑橘木虱相关样品。
7. 在附录 F 检测试剂配制及实时荧光 PCR 检测部分，将韧皮部杆菌亚洲种的荧光染料法检测引物 CQULasF03/CQULasR03 替 换 成 特 异 性 更 高 的 HLBas-G/CLas-4G ( 5 ' TCGAGCGCGTATGCGAATACG-3'/5'AGTCGAGCGCGTATGCGAAT-3')并增加荧光标记探针 HLBp(序列为 5 '-AGACGGGTGAGTAACGCG-3')，以进一步提高韧皮部杆菌亚洲种检测的特异性。
8. 增加附录 G 部分，增加靶标韧皮部杆菌亚洲种核苷酸还原酶β基因(nrdB 基因)的实时荧光PCR检测，以用于复测基于16S rRNA 基因引物 HLBas-G/CLas-4G 检测时 Ct 值大于35但小于40的样品。
本文件规定了柑橘黄龙病病原韧皮部杆菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)实时荧光PCR检测的样品制备、检测操作方法和结果判定标准。
本文件适用于对芸香科和非芸香科罹病植株和传病媒介柑橘木虱中韧皮部杆菌亚洲种的检测和病害鉴定。
更多详情请见附件。
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