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​变性琼脂糖凝胶电泳测定过程

来源: 上海抚生实业有限公司

2023/1/29 14:34:25 418

   实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。  变性琼脂糖凝胶电泳测定过程:

1、制胶
1 g琼脂糖溶于72 ml水中,冷却至60℃,10 ml的10 x MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% jia醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS电泳缓冲液
浓度  成分
0.4 M  MOPS,pH 7.0
0.1 M  乙酸钠
0.01 M  EDTA 
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

2、准备RNA样品
取3 ugRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
 
3、电泳
 上样前凝胶须预电泳5 min,随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。
 
4、紫外透射光下观察并拍照 
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

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