肉毒杆菌E/F型（CB-E/F）双重荧光PCR法优点：①灵敏度高、特异性强。

②时间短，2-3小时出结果。

③检测结果可定量。

④操作简便。

缺点：①对于已做支原体灭活处理的样品，由于支原体DNA仍旧存在其中，PCR结果会出现假阳性。（可用培养法做补充验证）

②不同厂家生产的试剂盒质量差异巨大（由于引物及内在设计不同），需谨慎选择，尽量在业人员推荐指导下使用。

组成及试剂配制:

1、酶标板：一块（96孔）

2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3、 样品稀释液：1×20ml。

4、 检测稀释液A：1×10ml。

5、 检测稀释液B：1×10ml。

【质量控制】

              1．阴性对照：Ct 值＞38 或未检出。

              2．阳性对照：扩增曲线呈 S 型，且 Ct 值≤30。

              3．同一实验以上要求需同时满足，否则本次实验视为无效。

              4．每种检测靶标都需设阴阳对照，不同的靶标根据对应阴性调整基线阈值。

【结果判读】

              1．FAM 通道检测 B 组链球菌。

              2．阴性：Ct 值＞38 或未检出。

              3．阳性：扩增曲线呈 S 型，且 Ct 值≤35。

              4．可疑：扩增曲线呈 S 型，且 35＜Ct 值≤38，需复检；复检结果若一致，判定结果为阳性。

【检验方法的局限性】

              1．样品采集、运输、保存不当，试剂运输、保存、配置不当都可能会影响实验结果，甚至会导致假阴性结果。

              2．如果实验室污染、试剂污染、样品交叉污染，可能出现假阳性结果。

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