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PCR 反应体系由什么组成?

来源: 上海邦景实业有限公司

2024/12/9 13:54:07 37

PCR 反应体系由反应缓冲液(10×PCR Buffer)、脱氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、 耐热 DNA 聚合酶(Taq 酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1Primer2)、靶序列(DNA 模板) 五部分组成,各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。
1、反应缓冲液:一般随 Taq DNA 聚合酶供应。标准缓冲液含:50mM KCl10mM Tris-HCl
pH8.3 室温),1.5mM MgCl2Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高,使反应特异性降低;浓度过低,使产物减少。在各种单核苷酸浓度为 200μ时, Mg2+为 1.5mM 较合适。若样品中含 EDTA 或其它螯合物,可适当增加 Mg2+的浓度。在高浓度 DNA 及 dNTP 条件下进行反应时,也必须相应调节 Mg2+的浓度。一般 以 1.5-2mM(终浓度)较好。
2dNTP 高浓度 dNTP 易产生错误掺入,过高则可能不扩增;但浓度过低,将降低反应产物的产量。PCR 中常用终浓度为 50-400μ的 dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同,如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时(偏高或偏低),就会诱发聚合酶的错误掺入作用,降低合成速度,过早终止延伸反应。此外,dNTP 能与 Mg2+结合,使游离的 Mg2+浓度降低。因此,dNTP 的浓度直接影响到反应中起重要作用的 Mg2+浓度。
3Taq DNA 聚合酶酶:在 100μ反应体系中,一般加入 2-4U 的酶量,足以达到每 min延伸 1000-4000 个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是,不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异,由于酶的浓度对 PCR 反应影响极大,因此应当作
预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时(如 20μ或 50μl),一般酶的用量仍不小于 2U,否则反应效率将降低。
4、 引物:引物是决定 PCR 结果的关键,引物设计在 PCR 反应中极为重要。要保证 PCR 反应能准确、特异、有效地对模板 DNA 进行扩增,通常引物设计要遵循以下几条原则:
⑴、引物的长度以 15-30bp 为宜,一般(G+C)的含量在 45-55%Tm 值高于 55℃[Tm=4(G+C)+2(A+T)]。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列,碱基的分布应表现出
是随机的。
⑵、引物的 3’端不应与引物内部有互补,避免引物内部形成二级结构,两个引物在 3’端不应出现同源性,以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于 个,引物自身配对若形成茎环结构,茎的碱基对数不能超过 个由于影响引物设计的因素比较多,现常常利用计算机辅助设计。
⑶、人工合成的寡聚核苷酸引物需经 PAGE 或离子交换 HPLC 进行纯化。
⑷、引物浓度不宜偏高,浓度过高有两个弊端:一是容易形成引物二聚体(primer-dimer),二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时,容易产生非特异性产物。一般说来,用低浓度引物不仅经济,而且反应特异性也较好。一般用 0.25-0.5pM/μ较好。
⑸、引物一般用 TE 配制成较高浓度的母液(约 100μM),保存于-20℃。使用前取出其中一部分用 ddH2O 配制成 10μ或 20μ的工作液。
5、 模板:PCR 对模板的要求不高,单、双链 DNA 均可作为 PCR 的样品。虽然 PCR 可以 用极微量的样品(甚至是来自单一细胞的 DNA)作为摸板,但为了保证反应的特异性,一 般还宜用μ水平的基因组 DNA 或 104 拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品,某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增,但混有任何蛋白酶、核酸酶、 Taq DNA 聚合酶抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白,将可能干扰 PCR 反应。

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