在ELISA试剂盒免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。
其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃隔夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H2SO4 0.05ml终止反应。
结果判定主要以ELISA试剂盒比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率zui大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。
有关试验的试剂及器材均见ELISA试剂盒部分。
C要说明的是，本法为ELISA试剂盒直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的zui适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA试剂盒实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法)，以达到zui适的实验条件。
注意事项
1. 在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高(zui低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。"
2. 所使用ELISA试剂盒的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则，影响标记效果。
3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。
4. ELISA试剂盒浓的标记物相当稳定，常加入30～40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数周。ELISA试剂盒已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。