江苏科特商贸有限公司

仪表网免费11

收藏

生物实验中细胞融合前准备

时间:2015-08-17      阅读:256

一、骨髓瘤细胞系的选择

    骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系有P3/X63-Ag8X63)、P3/X63-Ag8.653X63-Ag8.653)、P3/NSI-1-Ag4-1NS-1)、P3/X63-Ag8.UlP3Ul)、SP2/0-Ag14SP2/0)、F0S194/5.XXO.BU.1MPC11-45.6TG1.7210.RCY3.Ag1.2.3GM15006TG-A12U-266AR等。

    骨髓瘤细胞可用一般的培养液,如RPMI1640DMEM培养基进行培养。小牛血清的浓度一般在10%20%,细胞浓度以1045×105/ml为宜,zui大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时,可按13110的比例传代。每35天传代一次。细胞在传代过程中,部分细胞可能有返祖现象,应定期用8-氮*进行处理,使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

   在组织培养中,单个或少数分散的细胞不易生长繁殖,若加入其它活细胞,则可促进这些细胞生长繁殖,所加入的这种细胞被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中,许多环节均需要加饲养细胞,如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量一般为2×104105细胞/孔。

二、细胞融合的步骤

    细胞融合一般包括制备饲养细胞层、制备免疫脾细胞、制备骨髓瘤细胞及融合等四个步骤。

    制备饲养细胞层时一般选用小鼠腹腔巨噬细胞,与免疫小鼠相同品系的小鼠,常用BALB/C小鼠,610周后拉颈处死;浸泡在75%酒精内,35min后用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜,用*注入56ml预冷的培养液(严禁刺破肠管),反复冲洗,吸出冲洗液放入10ml离心管,1200rpm分离56min后,用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清FCS)的培养液混悬,调整细胞数至1×105/ml,进行培养。

  制备免疫脾细胞时先将zui后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死,无菌取脾脏,培养液洗 一次后,将脾脏研碎,过不锈钢筛网后离心,细胞用培养液洗2次,计数后取108脾淋巴细胞悬液备用。

  制备骨髓瘤细胞时应取对数生长骨髓瘤细胞离心,用无血清培养液洗2次,计数后取1×107细胞备用

  融合时先将骨髓瘤细胞与脾细胞按11015的比例混合在一起,在50ml离心管中用无血清不*培养液洗1次,离心后弃上清,用吸管吸净残留液体,以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略松动。在90s内加入37预温的1ml 45%PEG(分子量4000)溶液,边加边轻微摇动。37水浴作用90s。每隔2min分别加入1ml2ml3ml4ml5ml6ml的不*培养液以终止PEG作用。离心弃上清,用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。将上述细胞,加到已有饲养细胞层的96孔板内,每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种496孔板。将培养板置375%CO2培养箱中培养。


上一篇: 冷冻细胞活化的方法 下一篇: 细胞的复苏实验
提示

仪表网采购电话