dPCR技术概述

现象—加热导致气泡产生及影响

dPCR 技术实现上述优异性能表现的关键步骤是生成大量统一且独立的分区，通常通过两种策略来实现：

• 一种是基于微孔，将样品分配到数千到数万个微孔腔室中；

• 另一种是基于液滴的，将样品分成皮升到纳升的液滴，分散在不混溶的油中。

无论哪种分区方式，完成分区后，都要利用温度控制模块对所有微反应单元进行温度循环以完成扩增反应，从而将目标片段进行信号放大。然而，在温度循环中的问题是溶解在PCR反应体系或油相中气体的逸散，根据气体的溶解性质，气体在液体中的溶解度会随着温度升高会大幅度降低^[2]，而这一特性对数字PCR来说，尤为重要。

图1.（图片来源：罗氏诊断整理）

PCR反应过程中伴随着剧烈的温度升降，由于温度升高时气体溶解度降低，会因脱气（degassing）而形成微小气泡。脱气是芯片上聚合酶链式反应 (PCR) 失败的一个的原因，气泡的形成会对数字PCR反应会产生诸多方面的影响，如导致加热不均匀，挤压 PCR混合物从反应室排出，出现的气泡可能会取代反应室中的乳液，以及对液滴施加剪切力，从而导致液滴合并等问题，这些事件的发生均会对微孔阴阳性判断造成干扰，进而对定量的准确性产生影响^[3]。

图2.（图片来源：罗氏诊断整理）

如何防止气泡形成？

表1.（来源：罗氏诊断整理）

气体在液体的溶解度除了受到温度的显著影响以外，气压变化也会明显改变气体溶解度。一般来说，随着气压的增加，气体在液体中的溶解度会随之升高^[2]。因而，对数字PCR体系进行系统加压以增加气体在液体中的溶解度，是预防气泡形成的有效手段。

已有研究表明，具有主动外部压力产生的加压系统可以避免dPCR反应过程中气泡产生的现象，能够有效降低数字PCR在扩增循环中由于温度急剧变化带来的气泡形成和扩散，进而避免了由此导致的微反应单元独立性受损的情况，为精准定量提供保障^[5]。

图3.（图片来源：罗氏诊断整理）

此外，芯片法数字PCR技术在微孔生成的时候，由于反应体系表面张力与芯片表面处理等原因，仍然有一定几率出现“空泡”现象，即某些微孔无法被反应体系填充，而是被气体占位，PCR加热过程会导致气泡膨胀，会对周围的反应孔产生挤压并导致反应体系的逸散，原本封闭的独立反应单元无法独立进行片段扩增，将会对定量结果产生显著的影响。因此，对反应体系进行系统加压，也是有效限制高温导致的气泡膨胀行之有效的办法。

值得一提的是，这类“空泡”微孔在信号采集时容易被误认为阴性微孔，而实际上这类微孔不应该被纳入阴阳性计算。因此，数字PCR的反应体系具备质控成为一个非常重要的条件，该条件可通过在体系中添加特定的荧光染料予以实现。扩增完成后，应在进行微孔阴阳性判断前通过质控染料将假阴性孔排除，再分别对阴阳性微孔进行计数，最后才能通过泊松分布校正得到更为准确的定量结果。