*是一种对革兰氏阴性菌以及阳性菌都 有很好抑制作用的抗生素，曾经对畜禽疾病的控 制和治疗起到了特别重要的作用。由于*药 性比较稳定而且价格比较便宜，在养蜂业中经常 会使用*，用于防止蜜蜂爬蜂病，因此蜂蜜 中可能含有*残留。如果大量食用含有氯霉 素残留的食物会使人产生耐药菌株，而且会破坏 人体内正常菌群的平衡状态。*存在严重的 副作用，能引起人的再生障碍性贫血、粒细胞缺 乏症等疾病。因此，美国规定在动物性食品中不 得检出*，欧共体不允许*用于产奶母 牛和产蛋鸡。欧盟已明文规定了*等多种抗 生素药物不再作为兽药使用。国外对进口蜂蜜中 *的残留*定在0.1 µg/kg。

抗生素残留检测方法目前主要有微生物法、 理化检测法、免疫分析法。微生物法存在 操作时间长、结果偏差大等缺点，很难定量检 测。理化检测法需要昂贵的检测仪器及专业的操 作技能，结果准确，常作为最终确证的方法。色 谱或色谱-质谱联用技术是目前比较成熟而且可以 投入到实际操作的抗生素检测技术，优点是灵敏 度较高、分辨率高，可进行定性和定量分析，同 时可检测多个抗生素种类，但是由于前处理步骤 较多，费时，而且需要大型仪器设备，所以很难 在一些小型的食品检测企业或农场进行推广，仅 仅适用于检验检疫部门用来作为终判的方法。因 此，更加简单快速、低成本的分析检测方法需要 被开发出来以满足实际生产的需要。免疫分析法 具有特异性强、灵敏度高、操作简单、通量性高 等优点，已逐渐成为初筛的方法。免疫分析 法的基本原理是抗原或半抗原和抗体发生特异性 的免疫反应，常用的方法包括试纸条法和酶联免 疫吸附法。试纸条法简单快速，酶联免疫吸附法 可以定量，但一次只能检测一个指标。

蛋白质芯片方法又称蛋白质微阵列，是在基 因芯片之后发展起来的一种分析方法。其原理是 对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的大 量蛋白(如酶、抗体、抗原、细胞因子等)有规律 地固定在上面，根据这些大分子蛋白的特点，捕 获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血 浆、淋巴、组织液等)，然后用芯片分析仪进行扫 描，对结果进行分析。蛋白质芯片方法在动物源 性食品抗生素残留的检测方面应用很广泛。 蛋白芯片方法是一种高通量的检测方法，能在一 次实验中提供大量的信息。灵敏度高，可以准确 检测出蛋白样品中微量蛋白的含量，检测水平已 达纳克级，而且所需的样品量少。可以大大降低 检测的成本，同时也提高了检测的效率。目前， 蛋白芯片方法逐渐成为免疫分析方法的发展方向 之一，受到越来越广泛地重视。

NaCl、KCl、NA2HPO4 .12H2O、KH2PO4、吐 温20、乙二胺四乙酸(EDTA)：分析纯，南京化学 试剂有限公司；牛血清白蛋白(BSA)：99%，w/w 美国默克公司；*标准品：Sigma公司；氯霉 素抗体、纳米材料标记的二抗、银增强显色溶液 (A液、B液)：南京祥中生物科技有限公司。 实验所用水均为18.25 MΩ/cm纯净水(Milli-Q 水净化系统)。10 mmol/L PBS(磷酸盐缓冲液) pH7.2作为分析缓冲液。洗涤缓冲液PBS含0.05% 吐温20(PBST)。封闭剂为1% BSA。所有缓冲液在使用前通过0.22 µm孔径过滤器过滤。生物芯片点样仪：清华大学；ELx50自动洗板 机：美国biotech仪器有限公司；MD-200恒温振荡 仪Thermo-shaker、Qarray 2000芯片分析仪、96孔 板芯片载体：南京祥中生物科技有限公司；涡旋 混合器、Lx-100手掌型离心机：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；单道可调移液器：百得 实验室仪器苏州有限公司。

称取10 mg*和丁 二酸酐溶于1 mL丙酮，振荡反应1.5 h。于40 ℃ 氮吹后，加入200 µL DMSO溶解残留物，再分别 加入200 µL 5 mg/mL EDC和NHS溶液，振荡反应 2 h。再加入2 mL 5 mg/mL BSA溶液，振荡反应4 h，4 ℃下用1xPBS透析3 d，然后分装，—20 ℃冷 冻保存备用。

阳性对照和制备得到的氯 霉素抗原溶液(CAP-BSA)用生物芯片点样仪在96 孔板芯片底部制备阵列。共6个阵列点(2×3阵 列)，每个阵列点约40 nL，阵列间距约500 µm的 微阵列生物芯片，每个溶液重复3个阵列点。点样 后，在37 ℃下孵育2 h。为了减少非特异性吸附， 固定后每孔加入200 µL 10 mg/mL BSA，在37 ℃ 封闭1 h。封闭后，生物芯片孔板用1×PBST缓冲 液洗板，拍干，然后用铝箔袋密封存储在2～8 ℃ 备用。

本论文采用的 是间接竞争微阵列免疫分析原理，见图1。在微 阵列免疫分析中，进行了以下实验过程。每孔中 加入25 µL标准品或样品，再加入已知量的25 µL 混合抗体，25 ℃振荡反应30 min(振荡速度600 r/ min)。清洗后再加入50 µL AgNPS标记的羊抗鼠 IgG，37 ℃振荡反应30 min(振荡速度600 r/min)。 洗涤后再加入50 µL银增强显色溶液(包括溶液A和 溶液B)，在37 ℃中避光反应12 min。显色反应结束后，再清洗3次。

2 结果与讨论

2.1 *抗原的紫外表征

*、BSA都有紫外吸收，但偶联后的抗 原，由于共轭体系等的变化，使得其紫外吸收光 谱曲线和λmax都会发生相应的改变。因此可以用来鉴定抗原是否偶联成功。*的浓度为0.01 mol/L，BSA的浓度为1 mg/mL，紫外吸收光谱见 图2。由图2可知，*的吸收波长为270 nm，BSA的吸收波长为280 nm，偶联后氯霉 素抗原的吸收波长为276 nm，与*相比 吸收波长发生了红移，说明*抗原偶联 成功。2.2 抗原、抗体和二抗浓度优化 *抗原、抗体、二抗浓度是影响竞争性 免疫检测灵敏度的主要因素，因此检测前要对其 浓度进行优化。在本文中，*抗原浓度分 别为1:4，1:8，1:16稀释；抗体分别为1:80000、 1:160000、1:240000、1:320000稀释，二抗1:50、 1:100、1:200稀释。 抗原抗体的浓度低，灵敏度高，但相对灰度 信号值(RLUs)也会降低。综合两者，选择相对灰 度信号值在40000左右，确定测定条件为： *抗原浓度为1:8，抗体质浓度均为 1:160000，二抗浓度为1:100。

本论文开发的蛋白芯片快速检测方法具有操 作简单、高通量、快速低成本等特点。*的 检出限是0.02 ng/mL，定量限为0.03 ng/mL。本方 法灵敏度高，同时也不需要复杂的样品前处理。 因此，新开发的蛋白芯片方法，具有良好的灵敏 度和简单的仪器设备，同时具有较低的检出限和 较好的回收率。利用蛋白芯片法可以快速准确测 定蜂蜜中的*残留量，具有快速、并行性、 高通量的特点，适用于现场大规模样品的初筛。 在动物源性食品残留抗生素的含量检测方面有广 阔的发展前景。