中药活性成分的高效分离与结构鉴定为中药化 学生物学的重要组成部分，从传统名贵、疗效确切的 中药中快速发现活性成分对于阐明药效物质及其作用机制具有重要意义。*是传统名贵药材血竭 的代用品，其功效与血竭基本一致，具活血散瘀、定 痛止血、敛疮生肌之功效。*基原植物百合科龙血树属植物剑叶龙血树 Dracaena cochinchinensis 主要分布在东南亚各国以及我国云南、广西等地。 现代药理研究表明*总提物及单体成分具有脑 缺血保护、心肌保护、抗动脉粥样硬化等广泛的药理 活性。

高效液相-离子阱-飞行时间质谱仪( 日本岛津 公司) ; Varian INOVA-500M 核磁共振仪( 美国 Varian 公司) ; UV-2450 紫外-可见分光光度仪( 日本岛 津公司) ; Nexus 470 FT-IＲ 傅立叶变换红外光谱仪， KBr 压片( 美国热点尼高力公司) ; Autopol Ⅳ全自动 旋光测定仪( 美国鲁道夫公司) ; JASCO 815 圆二色 谱测定仪( 日本光电株式会社) ; Milli Q 超纯水机 ( 美国 Millipore 公司) ; F-1 型三用紫外分析仪( 江苏 海门市其林贝尔仪器制造有限公司) ; DZF-6090 真 空干燥箱( 上海申贤恒温设备厂) ; 旋转蒸发仪( 瑞 士步琦公司) ; DLSB-5/20 低温冷却液循环泵( 郑州长城科工贸有限公司) ; Buchi C-620 中压制备液相 色谱仪( 瑞士步琦公司) ; 半制备型高效液相色谱仪 ( 日本岛津公司) ; YMC-Pack ODS-A 半制备高效液 相色谱柱( 10 mm × 250 mm，5 μm) ; ODS C18 ( 40 ～ 63 μm，德国 Merck 公司) ; 薄层色谱 GF254硅胶预制 板和柱色谱硅胶( 200 ～ 300 目) 均为青岛海洋化工 厂生产。提取分离所用甲醇、乙酸乙酯、石油醚等溶 剂为北京化工厂生产，均为分析纯。高效液相所用 溶剂如甲醇、乙腈等为色谱纯，水为超纯水。 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞 ＲAW264. 7( 北 京协和医学院基础医学研究所细胞中心) ; 超净工 作台( 苏州安泰空气技术有限公司) ; CO2 培养箱 ( 日本三洋电机国际贸易有限公司) ; 倒置生物显微 镜( 厦门麦克奥迪实业集团有限公司) ; 多功能酶标 仪( 美国 PerkinElmer 公司) 。阳性药*( 美 国 Sigma-Aldrich 公司) ; *各萃取部位( DMSO 溶解，质量浓度 25. 0 g·L－1 ) 、化合物 1 和 2( DMSO 溶解，浓度 25. 0 mmol·L－1 ) 。 *购买于广西中医学院制药厂 ( 批 号 ) ，为剑叶龙血树 D． cochinchinensis 含脂木 材的乙醇提取物，标本存放于北京中医药大学中药 学院中药现代研究中心。

*成品 950 g，依次用石油醚、 乙酸乙酯回流提取( 8 L×3，每次 2 h) ，合并提取液， 减压回收溶剂，得到石油醚提取物 65 g、乙酸乙酯提 取物 600 g、药渣 265 g。*乙酸乙酯提取物 600 g，经硅胶柱色谱分离，依次用石油醚-乙酸乙酯( 10 ∶ 1 ～ 1 ∶3) 、二氯甲烷-甲醇( 20 ∶ 1 ～ 0 ∶ 1) 洗脱，得到 15 个流分( Fr． A ～ O) 。LC-MS 分析发现 Fr． H 为黄酮 寡聚体( 相对分子质量大于 500) 的富集部位。Fr． H( 128 g) 经过硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯 ( 3 ∶1 ～ 0 ∶1) 洗脱，得到 3 个流分( Fr． H1 ～ H3) 。Fr． H2 经中压制备液相分离( ODS 柱，50 mL·min－1 ， 50% ～ 99% MeOH) 得到 5 个流分( Fr． H2a ～ H2e) 。 Fr． H2b 经半制备液相( 甲醇-水 45 ∶ 55) 纯化，得到 化合物 1( 10. 5 mg，tＲ 63. 5 min) 。Fr． H2c 经半制备 液相( 甲醇-水 58 ∶42) 纯化，得到化合物 2( 8. 2 mg， tＲ 38. 3 min) 。

测试条件 Agilent ZOＲBAX SB-C18色 谱柱( 4. 6 mm×250 mm，5 μm) ，流动相为水( 0. 1% 甲酸) ( A) 和乙腈( B) ，梯度洗脱条件如下: 0 ～ 30min，5% ～ 95% B; 流速 1 mL·min－1 。质谱分析在正 负离子模式下测定，ESI 作为离子源，检测电压 1. 40 kV，飞行时间区域( TOF) 压力 1. 5×10－4 Pa; 离子阱 区域( IT) 压力 1. 9×10－2 Pa; 干燥气压力 100. 0 kPa; 雾化气流速 1. 5 L·min－1 ; 曲线脱溶剂系统( CDL) 温 度 200 ℃ ; 扫描范围 m / z 100 ～ 1 500。

ＲAW264. 7 细胞释放 NO 活性筛选 活性测试在 LPS 刺激的 ＲAW264. 7 细胞 NO 释放 模型 上 完 成，具体实验方法参照文献。 ＲAW264. 7 细胞用 DMEM 细胞培养液( 含 10% FBS 与 1%青-*双抗液) 置于 37 ℃，5%CO2 环境下 湿化培养。细胞以 2×104 个/mL 接种于 96 孔细胞 培养板后，于 37 ℃，5%CO2 培养箱中培养 24 h，用 不同浓度待测萃取部位( 5，50 mg·L－1 ) 、单体化合物 ( 4，20，100 μmol·L－1 ) 作用于 ＲAW264. 7 细胞 1 h 后，加入终质量浓度 0. 5 mg·L－1 的 LPS，24 h 后， MTT 方法检测细胞生长状况，NO 检测试剂盒检测 细胞培养液中 NO 浓度，并计算*各萃取部位 和单体化合物在没有细胞生长抑制浓度下对 NO 分 泌的抑制率。阳性药为*。

利 用 LPS 刺 激 的 ＲAW264. 7 细胞 NO 释放模型测定*总提物、 乙酸乙酯部位、石油醚部位的潜在抗炎活性，结果表 明在低质量浓度( 5 mg·L－1 ) 下，上述部位的 NO 抑 制率分 别 为 ( 3. 9 ± 9. 9) %，( 1. 6 ± 9. 8) %，( 7. 8 ± 4. 8) %，且无明显的细胞毒作用; 在高质量浓度( 50 mg·L－1 ) 下，*乙酸乙酯部位、石油醚部位的 NO 抑制率分别为( 25. 5±4. 5) %，( 5. 6±6. 00) %，无 明显的细胞毒作用; *总提物显示出细胞毒作 用，细胞生长抑制率达( 31. 7±1. 5) %。*乙酸 乙酯部位较石油醚部位呈现出更好的抑制 NO 释放 活性，因此对活性较好的乙酸乙酯部位进一步分离。

经过文献调 研发现，*中简单黄酮相对分子质量主要集中 在 250 ～ 350，黄酮二聚体相对分子质量在 450 ～ 650， 黄酮三聚体的相对分子质量在 700 ～ 800。为了得到 结构新颖的黄酮寡聚体成分，对*乙酸乙酯部 位经硅胶柱分离得到的 15 个流分进行 LC-MS 分 析。从 MS1 图谱中可以发现 Fr． H 中主要色谱峰的 准分子离子峰信号位于 m /z 500 ～ 800，由此判断该 流分富含黄酮寡聚体类成分。Fr． H 经硅胶柱分离得到的各个流分进一步行 LC-MS 分析，其中 Fr． H2 色谱图呈现 2 个主要色谱峰，负离子模式下显示准 分子离子峰分别为 799. 315 0( ［M + HCOO］－ ) 和 767. 319 1( ［M－H］－ ) ，结合二级碎片离子推测其为 黄酮三聚体类成分。选取这 2 个信号其为目标化合 物，进行导向性分离。采用 LC-MS 追踪，进一步发 现流分 Fr． H2b，Fr． H2c 中分布有目标化合物，行半 制备液相分离纯化目标成分。

本文利用活性追踪并结合 LC-MS 分析的 方法，从*中快速识别、分离得到了 2 个黄酮三 聚体化合物。其中，化合物 1 为新化合物，化合物 2 为从该种植物中分离得到。本文是发现该 植物中存在二氢查耳烷环合型三聚体。化合物 1 和 2 能够显著地抑制 LPS 刺激的 ＲAW264. 7 细胞释放 NO，具有潜在的抗炎作用。本研究为*药效物 质的阐明和进一步开发利用奠定了基础。