荧光假单胞菌的检测方法有哪些？

荧光假单胞菌的检测方法有哪些？

荧光假单胞菌（P.Fluorescens）是一种环境污染菌。对于人类是一种罕见的机会致病菌。荧光假单胞菌属于假单胞菌属，是化能异养型的革兰氏阴性菌，呈杆状，有鞭毛。能分泌黄绿色荧光色素发出荧光，能产生抗生素、水解酶等代谢产物，在 4℃-37℃范围内，中性环境中生长，生理生化特性显著，是作为嗜冷菌是牛奶中危害大的微生物。

荧光假单胞菌的检测方法

目前我国对乳制品中嗜冷菌数量的检测采用国家标准NYT 1331-2007中平板计数的方法，对荧光假单胞菌没有专门的国标，但是国内外对荧光假单胞菌检测技术有丰富的研究。

⒈平板计数法

乳品联合会（IDF）采用 IDF Standard 101A 和 IDF Standard 132A检测标准，前者采用 6.5℃培养10天后平板计数，后者 21℃培养 25h后计数，132A培养时间短稳定性好，菌数较为准确。平板计数法将原料乳稀释后，采用涂布法，倾注法，3M细菌总数试纸等方法进行计数，倾注法由于温度较高导致精确度较低，3M 试纸精确度和效率较高。平板计数法是传统的检测方法，计数准确，但耗时太长，25h远达不到工业生产快速检测的要求。

⒉直接荧光过滤法

直接荧光法DEFT（Direct Epifluorescent Filter Technique）是利用电离辐射对食品样品菌落计数的方法，操作简便，具有高通量性。将样品通过过滤器后，吖啶橙染色，在紫外显微镜下活细胞能观察到橘黄色，而死细胞染成绿色，可以统计出样品中所有菌落的总数。原料乳用滤膜过滤后染色，计数得荧光假单胞菌相关性系数为0.91，且在25min内完成检测。相对于传统的平板计数方法，DEFT 大大缩短检测时间，利用其原理，可以实现对多种食品中菌落数的快速检测。但是 DEFT 的灵敏度不高，只能用于检测一定范围内菌落数，当食品中菌数含量较少时没有良好的线性关系，且实验仪器比较昂贵，在工业生产中不能很好的适用。

⒊流式细胞法

流式细胞法FCM（Flow Cytometry Method）可以检测菌液中标记荧光信号的单细胞，对菌株实现逐一定量分析。流式细胞法检出的菌数是平板计数法的 3.8 倍，因为能统计到总体菌落数量。利用这个方法检测牛奶中假单胞菌，能在4 h内完成检测，且在菌落数含量较少时灵敏度有很大的提高。此方法可以快速准确的检测原料乳中荧光假单胞菌含量，但流式细胞法操作过程较为复杂，且容易被多种因素影响检测到的结果。

⒋PCR 法

针对16S rRNA 保守序列设计引物，通过 PCR 扩增，可以将牛奶中嗜冷菌扩增出147bp的 DN段，标记后用 ELISA 检测，得到荧光假单胞菌AH-70 的OD450和菌浓度的方程，分析得此方法和平板计数法的相关系数达到 0.94，可以检测菌浓度范围是103-107CFU/mL。PCR 检测具有很高的灵敏度，特异性较强，有文献报道当原料奶中埃希肠杆菌的浓度达到 10CFU/mL 时能被检测出来。PCR 检测菌落数结果同样会受到死菌株数的影响，而且在现实生产中对食品提取可以PCR扩增的DNA难度很大，容易被食品体系中因素影响精确度。

⒌氨肽酶法

氨肽酶法通过革兰氏阴性菌细胞壁上的氨肽酶与特定的化合物反应，检测氨肽酶的活性。吕元等人用氨肽酶法，对杭州地区原料奶中荧光假单胞菌，阪崎肠杆菌和鲁氏不动杆菌 3 种优势嗜冷菌进行快速检测。结果得出 3 种菌的浓度和氨肽酶活性存在显著的相关性，且与传统的平板计数法的结果没有显著差异，可以在很大程度上缩短检测的时间。在检测冷藏肉类中嗜冷菌报道，氨肽酶法的检测范围是104-108CFU/mL，检测时间为2.5 h，与平板计数法结果的相关性为0.88。显然氨肽酶法能达到快速检测的效果，氨肽酶法适用于定性检测，可以根据反应颜色用肉眼观察，但检测灵敏度较其他方法差，大的问题是原料样品中的革兰氏阳性菌无法被检出，导致实验结果偏差。

⒍ELISA 法

ELISA 法通过抗体特异性反应检测菌落数，具有高灵敏性，也易于同其他方法结合。PicardC 等人通过测定酪蛋白糖多肽计算原料乳中嗜冷菌含量。利用单克隆抗体，检测出成品奶样中嗜冷菌，与平板计数法相关性达 0.96。从脱脂奶粉中检测6种沙门氏菌，检出线为10 CFU/mL，检测时间为3h。CrociL等人在对猪肉样品的检测中，将 ELISA 方法和 PCR 法、平板计数进行对比，得出前面两者都较为灵敏，低检出线为1-10个/25g，检测结果符合 ISO 规定。

⒎免疫磁珠法

免疫磁珠技术可以快速的富集乳制品中低浓度的菌，通过结合 PCR、ELISA等方法可以达到快速、准确的检测目的。吕琦等人通过对 4 中菌保守序列基因设计引物，建立多重 PCR 体系，在7-8h检测时间内，检测灵敏度达到 102CFU/mL，具有特异性。免疫磁珠技术检测在各个方面都表现出一定优势，改进得到嗜冷菌的保守序列能表现高通量性。对于免疫磁珠技术检测乳制品中菌浓度的研究报道较少，但是应用于检测有害化合物的研究都比较成熟，应用广泛。

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