细胞培养实验需要怎样的环境？

细胞培养实验需要怎样的环境？

一、无菌室

无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。

无菌室的消毒和防污染：为保持无菌状态，经常消毒是的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2小时），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。

实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。

此外，还应注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间；等。

二、超净工作台

工作原理：鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。

超净台的使用与保养：超净台的平均风速保持在0.32-0.48米/秒为宜，过大、过小均不利于保持净化度；使用前好开启超净台内紫外灯照射10－30分钟，然后让超净台预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台。

三、常用培养器皿及清洗消毒

细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作的。

清洗

离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都认真清洗，达到不含残留物的要求。

（一）玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤。

1、浸泡 : 新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。

2、刷洗 : 将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。

3、浸酸 : 浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于六小时，一般过夜或更长。放取器皿要小心。

4、冲洗 : 刷洗和浸酸后的器皿都用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”15次以上，后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。

（二）橡胶制品清洗

新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。

（三）塑料制品的清洗

塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。

清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。

（四）包装 : 对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。

消毒和灭菌

微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因

（一）物理消毒法

1、紫外线消毒:紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。

紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2米的30W灯可照射9平方米房间，每天照射2－3小时，期间可间隔30分钟。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5米照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米，照射时间30分钟为宜。

紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。

2、高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。

不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。

3、高温干热消毒：干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上，并保持90－120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。

干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。

烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。

4、过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。

关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。

（二）化学消毒：新洁而灭，其0.1％水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。

（三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。

可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。

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