心脏病仍是quanshijie范围内死亡的主要原因。当遭受心脏疾病时，心肌细胞（CMs）会被瘀痕组织替换，瘀痕组织不能完成收缩，因此不能参与泵血，导致剩余健康心肌组织压力增大，最终导致心力衰竭。在低等脊椎动物如蝾螈和斑马鱼中，心肌细胞能够高效的再生受损心脏。但是，在哺乳动物中，有丝分裂后的成熟心肌细胞对受损组织的修复能力有限，再生和修复损伤能力只能持续到出生的时候，此后，这种能力便会yongjiu消失。有趣的是，在新生小鼠中，心肌细胞增殖在出生一周之内足以修复心脏损伤，这一周的时间可以给科学家提供一个时间窗口来探究促进心脏再生的线索。

       今天，与大家分享一篇2017年由以色列威兹曼科学研究院的Eldad Tahzor 教授发表在Nature（IF=40.137）上的文章《The extracellular matrix protein Agrin promotes heart regenerationin mice》，作者发现新生小鼠心脏中的聚集蛋白(Agrin)似乎可以控制心肌细胞的再生过程。当将其注射到遭受心脏病发作的成年小鼠心脏中时，Agrin可以开启心肌细胞再生功能，修复受损心肌细胞。

图1 小鼠心脏ECM介导的CMs增殖中Agrin的筛选鉴定

       首先，为了研究细胞外基质（ECM）在心脏再生中的作用，作者选取新生小鼠（P1）和一周大（P7）的小鼠的ECM开展实验：将ECM中的细胞去除，仅留下基质，将其分别加入到体外培养的心肌细胞中，对心肌细胞Ki67指标进行检测。得出新生小鼠的ECM更容易使心肌细胞增殖（图1  a-d），且以MMP依赖的方式进行诱导（图1  e-h）。通过质谱方法确定新生小鼠（P1）和一周大（P7）的小鼠的ECM中主要区别成分为Agrin，这种物质促进心肌细胞增殖。通过RNA、Western  blot和免疫荧光分析进一步验证了新生小鼠（P1）ECM中Agrin含量更高（图1  i-k）。另外，还通过实验证明了Agrin可以在体外促进CM增殖（图1l）。

图2 Agrin延缓新生小鼠CMs成熟，是新生小鼠手术切除后心脏再生所必需的

       通过杂交手段，构建Agrin基因缺失的小鼠cKO（图2a）。对Agrin-cKO小鼠心脏中Agrin蛋白和mRNA表达的分析证实了等位基因被有效地删除（图2b-d）。Agrin-cKO-CMs的肌节结构表现出更成熟的状态，肌节α-肌动蛋白和T-小管标记物定位效果增强（图2e）。同样，在Agrin-cKO心脏中，通过western  blot（图2f）和线粒体标记物Tom20（图2g）染色对Myh6/Myh7比率的量化显著提高。P1  Agrin-cKO心脏切片显示横纹肌节染色增加，CMs细胞周期活性降低（图2h，i）。这些现象表明，Agrin在新生小鼠期会起到抑制CM成熟的作用（图2e-g）

       最后，检测Agrin-cKO小鼠心脏再生是否受损。P1小鼠接受心脏切除术，并在1周和4周后进行评估（扩展数据图5i）。采用Masson三色染色的组织学检查显示，相对于野生型小鼠，Agrin-cKO小鼠的纤维化程度升高（图2j-l），与心功能降低一致（图2m，n）。相应地，在Agrin-cKO心脏，CMs增殖减少（图2o，p）。综上所述，这些结果表明Agrin对于新生小鼠心脏再生是必要的，但对于出生后心脏的生长和维持并不是严格要求的。

图3 Agrin诱导成年小鼠心脏再生

       接着研究了重组Agrin是否能促进成年小鼠CMs的增殖和心脏再生（图3）。单次向心肌内注射Agrin（50μL,20μg/mL），PBS作为对照。Agrin处理可诱导邻近于幼年心脏和成年心脏梗死区健康心肌中的CMs重新进入细胞周期（图3a-c）。心肌梗死后4天的成年小鼠心脏组织学分析显示，两组受损区域相似，但从第14天开始，Agrin处理心脏瘢痕组织面积减少，到第35天显著减少（图3d、e）。此外，Agrin处理可以改善心肌梗死后的心功能，这两种模型的超声心动图都很明显（图3f、g）。与对照组相比，Agrin处理的小鼠还表现出壁厚的保留和对扩张型心肌病的保护作用（图3h）。

图4 Agrin通过Dag1、ERK和Yap信号转导促进CM增殖

       Dag1在P1心脏中广泛表达，然而到P8，其mRNA和蛋白质的表达jinxian于CMs（图4a-c）。Agrin处理后在P7心肌细胞培养中观察到短暂的ERK激活（图4d）。添加IIH6C4（一种针对Dag1-Agrin结合位点的阻断抗体）降低了Agrin诱导的ERK激活（图4e）。此外，使用PD0325901（PD，MEK抑制剂）或抗Dag1抗体（图4f，g）阻断Agrin诱导的p7   CM增殖。在P7培养的CMs中，Agrin诱导的肌节分解（扩展数据图8d）与Agrin治疗后*失去心肌肌钙蛋白T表达的CMs数量增加2.5倍一致（图4j）。Dag1能够与Dystrophin结合形成糖营养不良蛋白复合物（Dystrophin-glycoprotein   complex，DGC）。为了研究Agrin-DGC与信号分子Yap之间的联系，用抗Syntorphin抗体对免疫沉淀DGC蛋白进行了实验，并对复合物和Yap进行了印迹。DGC组分的Co-IP证实Agrin和Yap都会与DGC结合（图4k-l）。经过Agrin处理后，CMs中核Yap的百分比增加了3-4倍（图4m）。并且，Agrin在Verteporfin（Yap-TEAD转录活性抑制剂）存在下未能诱导CM增殖（图4n）。这一结果暗示了在Agrin诱导的CM增殖过程中Yap相关的信号机制。综上所述，生化分析表明，Agrin通过Dag1与DGC结合并降低其稳定性，随后导致肌原纤维分解和下游信号分子（包括Yap和ERK）的激活。

图5 Agrin促进hiPSC-CMs增殖并减弱其成熟

       研究Agrin能否促进人诱导的多能干细胞（hiPSC-CMs）在明胶涂层2D基质上的增殖。人或大鼠细胞活性周期与Agrin呈现浓度依赖性关系（图5a，b）。为了探讨Agrin是否能抑制hiPSC-CMs的成熟过程，采用3D贴片培养系统，分析了Agrin对hiPSC-CMs增殖和结构和功能成熟的影响。长时间给药处理（100   ng/ml，两周）可促进CMs周期活性增加2倍（图5c）。此外，Agrin处理的CMs表现出成熟延迟，主要表现为传导速度降低（图5d），一系列功能性和成熟性标记的表达显著降低（图5e，f）。综上所述，与对小鼠的研究结果一致，Agrin促进了hiPSC-CMs在二维和三维培养系统中的增殖并减弱其成熟。

总结

       文章揭示了Agrin作为新生小鼠ECM的一个重要组成部分，是新生小鼠心脏再生bukequeshao的成分。在体外，重组的Agrin分解DGC，并通过Yap和ERK介导的信号途径，诱导促进小鼠和人类多功能干细胞重新分化出心肌细胞。通过单次皮下注射Agrin到小鼠体内，也可以促进心肌梗死的成年小鼠的心脏再生。同时，Agrin也可以促进了hiPSC-CMs在二维和三维培养系统中的增殖并减弱其成熟。尽管该模型中观察到的CMs增殖程度表明还会有其他的作用机制，但这项研究结果得出ECM的成分可以促进心脏的修复，其中Agrin处理显示出作为一种相对安全有效的修复哺乳动物受损心脏的药物的潜力。Agrin的发现将有助于CMs再生生物医学进一步的研究。

       在该研究中，细胞成像技术在hiPSC-CMs的组织学分析中起到了至关重要的作用，一台能够迅速对多孔位细胞样品进行快速高通量测试的仪器可让研究工作达到事半功倍的效果。

       来自英国Plexithermo的HCells高通量单细胞、器官功能测量及纳米水凝胶3D培养系统：可针对单个细胞形态、细胞张缩力、张缩速度、张缩功率、离子浓度变化、细胞运动轨迹，方向和频率，以及速度或距离量化等进行批量测量，达到每小时300个以上单细胞的数据采集，真正实现高通量单细胞采集。

       采集数据包括多种单细胞力学指标：测细胞收缩的速度和细胞力度、细胞大小、面积、真正产生的功率，收缩时的角度x轴y轴，产生的速度差和力差等。此系统的全自动设计，测试一轮后，可以定位回到同一个细胞重复测量细胞的状态或者不同的处理。可以长期培养后，不同时间对同一个细胞进行测试。测量对象可以是贴壁细胞，如成年大鼠，成年小鼠，人源干细胞。高通量单细胞功能检测系统能够从细胞微观水平到组织宏观水平评估各种各样的运动范围、细胞运动轨迹、单个细胞力、硬度及离子浓度，如一个孔内一个小时测300个以上单细胞的收缩和离子浓度快速变化。

1、心肌细胞

采用超速成像纳米水凝胶技术。保证药物一定浓度水平下批量测心肌细胞的力学指标和离子浓度变化。测细胞收缩的速度和细胞力度、细胞大小、面积、真正产生的功率，收缩时的角度x轴y轴，产生的速度差和力差等，并且可以模拟器官硬度。通过轨迹分析选择跟踪区域和运动方向。软件对迁移单元的速度或距离进行量化。可以分析细胞运动的频率。细胞跟踪检测轨迹并提供定量数据跟踪功能还可以分析面积、周长和圆度等参数，使软件能够跟踪形状变化，例如体外心肌细胞。

2、细胞迁移和精子运动轨迹

跟踪函数检测细胞轨迹，并可以计算定量数据，例如：作为轨迹（xy图表），距离和速度。这使得系统具有检测和测量功能，例如细胞迁移和精子运动的轨迹。

3、动态跟踪可以分析细胞增殖的变化，如菌落形成。

4、人iPS细胞衍生神经细胞的细胞活力测定：

可以测量神经元的运动。神经元运动的功率谱密度（PSD）可用于准确预测细胞死亡。PSD表示一个单元在频域中的运动强度。神经元培养的PSD比传统的生存能力测量更精确地预测细胞死亡。

5、核跟踪特征可用于分析癌细胞迁移。

测量对象：癌细胞、斑马鱼、精子、菌落、贴壁细胞（如：急性分离的成年小鼠细胞，乳鼠细胞、成年大鼠的心肌细胞、骨骼肌细胞、

参考文献:

Elad  Bassat, Yara EidMutlak, Alex Genzelinakh et al. The extracellular  matrix protein Agrin promotesheart regeneration in mice. Nature,  Published online 05 June 2017,doi:10.1038/nature22978