多能干细胞（iPSC）经诱导可分化为心肌细胞（CM），从而产生人心肌的体外细胞模型即iPSC-CM。常规2D培养的iPSC-CM表型通常不成熟。3D培养可提高iPSC-CM的表型成熟度，但通常操作过程复杂，对设备要求高，细胞产量小，研究效率低。来自英国的研究人员Matthew  P.  Burnham等通过添加磁性金-铁氧化物纳米粒可将磁性细胞球精确定位在记录电极上，并基于此方法研究了共培养、胞外缓冲液成分、电起搏等因素对iPSC-CM的影响。以“A  Scalable Approach RevealsFunctional Responses of iPSC Cardiomyocyte 3D  Spheroids”为题发表在SLAS Discovery上。

研究背景

       成年心肌在细胞层面主要包括表型成熟的心肌细胞（CM）以及紧邻的心肌成纤维细胞。诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（iPSC-CM）为建立成人心肌细胞体外模型奠定了重大研究基础。但该模型中的iPSC-CM细胞通常表型不成熟，存在具有自发性qiboqi活性但搏动力度不足，肌浆网（SR）钙（Ca2+）调节发育不*和肌膜离子通道表达不足等缺陷。

       大量研究表明在2D单层细胞培养条件下，iPSC-CM体外表型成熟度会受到限制。而通过模拟各种生理条件如：3D矩阵和结构化支架、与非肌细胞支持细胞共培养、在弹性基层上的电起搏收缩行为和机械调节、以及适当利用能源等均能显著提高iPSC-CM的表型成熟度。对3D   iPSC-CM功能和结构研究方法很多，如iPSC-CM与非肌细胞支持细胞或细胞外基质蛋白一起形成条状或环状，用光学方式追踪其收缩性；通过在低粘附力表面或在悬滴中培养，iPSC-CM细胞能够自我组装形成3D结构，与视频显微术相结合也可检测其收缩性；还有基于染料或光遗传的报告分子、微电极、多电极阵列或力传感器等方法来研究3D  iPSC-CM的结构。但这些方法操作过程复杂，对设备要求高，效率极低，导致iPSC-CM产量偏低。

       因此想要进行更高效的iPSC-CM进行研究，我们需要新方法。在低粘附力表面或水凝胶上形成的球状体/微组织是zuijiandan的获取iPSC-CM   3D结构的方法，但由此产生的球状结构处于自由漂浮状态，跳动活跃难以操作，也难以可靠检测。本文研究人员通过将iPSC-CM与非肌细胞支持细胞和磁性金-铁氧化物纳米颗粒组装在一起形成unique共培养细胞球，并使所得的共培养细胞球带有磁性，能够被钕磁铁阵列定向和定位，从而将细胞球精确定位到2D iPSC-CM单分子层功能测量的96孔传感板的感应电极上（CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH），通过记录收缩力（阻抗）和细胞外场电位（EFP）检测细胞球生理指标。这是shouci以整板形式进行3D  iPSC-CM功能检测，同时结合96孔液体处理平台和声学分配软件，实现了高通量操作。为研究3D  iPSC-CM模型是否可以应用于成年心肌的更多生理学研究，研究人员还探究了成纤维细胞共培养（人原代培养的成纤维细胞和小鼠成纤维细胞系）、细胞外缓冲液组成和电起搏等因素的影响，证明该方法具有高效、可扩展性。

结果

       为构建3D iPSC-CM细胞球模型，研究人员向iPSC-CM和成纤维细胞共培养体系中加入金-铁氧化物纳米粒子，形成的磁性细胞球可被磁性阵列吸引并定位到感应电极上，检测率可达95%以上，且定位附着后的细胞球依然能够维持良好的3D结构。

图1. iPSC-CM共培养球形团簇的自组装及平板阵列的制备。（a）工作流程示意图，将共培养细胞在超低附着装配板中与铁-金纳米粒子一起组装成共培养细胞球，并使用与电极位置对齐的定制磁铁阵列将球体沉积到记录电极上，然后将其转移到传感器板上（CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH）。（b）iPSC-CM细胞在接种后4天内（第1-4天）以iPSC-CM单独或与成纤维细胞（fb）共培养形式组装到传感器板中。（c）钕磁铁阵列示意图（尺寸与传感器板中12×8电极阵列位置相同）。(d)  石蜡切片HE染色表明金-铁氧化物纳米粒子进入球体（白色箭头），且球中心无坏死。(e)  iPSC-CM球体附着到包被过的传感板电极4天后，进行中性红染色，发现3D结构保持良好，并无2D单层细胞出现。

       研究人员对iPSC-CM   3D磁性细胞球模型进行了多项成熟度检测。通过传感器阻抗检测，发现加入金-铁氧化物纳米颗粒并不会改变细胞球的搏动特性，培养2天的细胞球搏动稳定，搏动率为0.8±0.04Hz或49±2.4  bpm，幅度<5 ohm。400 nM异丙肾上腺素（L型Ca2+通道抑制剂）处理后搏动频率提高，1μM维拉帕米（β-肾上腺素受体激动剂）处理后搏动停止，与已知的药理学作用一致（图2，表1）。在给药方面，研究人员基于96孔液体处理平台（CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH）构建了一种高效配液给药方法，从培养记录板中吸出一部分温热的培养基，将其与DMSO储备溶液快速混合，然后再次分配回培养记录板。该方法操作简单，用时短，可做到同时给药且浓度均一，极大地避免了人工操作带来的各种影响，且给药期间记录板中温度变化在0.5℃范围内。

图2   通过阻抗感应检测iPSC-CM球的收缩参数。(a)单个球收缩和规律搏动时的10s阻抗曲线向下偏转。(b)搏动特征在较长时间内保持稳定。(c)蓝色曲线：400  nM异丙肾上腺素；黑色曲线：1  μM维拉帕米；灰色曲线：对照。(d)c图的平均数据。(e)使用自动液体操作进行累计添加维拉帕米，产生的浓度-响应数据，n=9次重复。研究人员探究了成纤维细胞共培养对iPSC-CM细胞球的影响。发现与小鼠和人成纤维细胞共培养，iPSC-CM细胞球搏动幅度分别增加约15倍和6倍（图3a）。代表搏动偏转的矢量幅度增加了10倍以上（图3b）成纤维细胞接种比率也影响搏动率。iPSC-CM细胞球的搏动幅度随人成纤维细胞接种比例的增加而增加，但其搏动幅度随小鼠成纤维细胞的接种比例增加而降低（图3c和d，表1）。然而在不同的时间点，不同成纤维细胞的播种比例都会让iPSC-CM细胞球产生强烈的收缩，表明其收缩力对成纤维细胞本身的存在更为敏感，而不是精确的成纤维细胞接种比率。

图3  与成纤维细胞共培养可以显著调节iPSC-CM的固有收缩行为。(a)阻抗记录表示搏动幅度，iPSC-CM球(CM  only)，小鼠胚胎成纤维细胞共培养球（CM-Fb），原代人成纤维细胞共培养球(CM-hCFb)。(b)光学方法检测组装板中的搏动特性，发现成纤维细胞共培养对iPSC-CM搏动幅度有显著影响，(i,只有iPSC-CM;  ii, MEF共培养)。(c和d)增加人(i或空心正方形)或小鼠(ii或实心正方形)成纤维细胞比例对阻抗传感搏动幅度和速率的影响。

CM，iPSC-CM细胞球；CM_Nano，含金-铁氧化物纳米颗粒的细胞球；CM_Fb_Nano，含金-铁氧化物纳米颗粒并与成纤维细胞共培养的细胞球。搏动特性以阻抗形式量化。

减少肌膜Ca2+内流的电起搏揭示了肌力反应

       正肌力药如异丙肾上腺素，通常引起iPSC-CM共培养球体出现变时性反应而不是变力性反应（图2a），可能反映了与肌膜相比，iPSC-CM共培养球体的肌浆网Ca2+处理能力相对欠发达。通过调整台氏液中Ca2+浓度减少肌膜Ca2+内流，结合电起搏以控制搏动速率。在这些条件下，100 nM异丙肾上腺素使iPSC-CM共培养球体搏动幅度增大约两倍（图4a）。细胞外Ca2+浓度滴定，从1.5 mM开始，表明在0.9 mM或更低的浓度时具有浓度依赖性，在0.6 mM更明显（图4b）。本研究未检查起搏的长期效应，但在0.9 mM Ca2+没有异丙肾上腺素刺激的情况下，起搏20s后的zuihouyi次搏动较diyi次搏动幅度已经增加了1.24±0.8倍。在对照培养基或1.5mM 台氏液条件下，这种作用是不存在的（图4c），这证实了该机制与肌膜Ca2+内流减少有关。尽管iPSC-CM共培养球体的应力-应变关系尚未量化，但鉴于共培养球体弹性系数（刚度）在急性实验期间保持不变，iPSC-CM共培养球体中的力产生（应力）可以由搏动幅度（应变）的相对变化来表示。与异丙肾上腺素相似，digaoxin（Na+/K+ATPase抑制剂）和xidinafei（5型磷酸二酯酶抑制剂）在基础条件下均未引起搏动幅度反应的增加。然而，在电起搏或者Ca2+浓度降低的条件下，digaoxin引起明显的肌力反应（搏动幅度增加1.9±0.5倍），而xidinafei则无正性肌力作用（0.8±0.1倍）。这种情况可能由于digaoxin是一种非β-肾上腺素能机制的正性变力因子，而xidinafei在离体心肌细胞中是通过HCN（超极化激活环核苷酸门控通道）通道被激活起作用的。

图4 肌力反应受胞外Ca2+浓度和电起搏调节。(a)在含0.6 mM Ca2+的台式液和1 Hz电起搏条件下，100 nM异丙肾上腺素能够使搏动幅度(肌力反应)增加。异丙肾上腺素添加前(实线)/后(虚线)。标准化之后搏动曲线宽度变小。(b)在同等搏动条件下对异丙肾上腺素刺激产生的肌力反应要求胞外Ca2+水平低于1.2 mM。(c)含0.9 mM Ca2+的台式液且无异丙肾上腺素参与条件下，搏动20s之后的振幅(实线)较diyi次搏的动振幅(虚线)有所增加，但在对照组或1.5 mMCa2+台氏液组并没有这种现象。(d)正性肌力药物digaoxin(1μM)能够引起与异丙肾上腺素类似的波动幅度增加，但磷酸二酯酶抑制剂xidinafei(10 μM)不会产生类似效果。

自主搏动的3D球体中细胞外电位(extracellularfield potentials，EFPs)的检测

      EFP可以通过记录自主搏动的iPSC-CM共培养球体来检测（图5a）。使用维拉帕米（100 nM）和L型钙通道激活剂BayK-8644（1 µM）处理，分别导致EFP明显缩短和延长（图5b，c），与已知的结果一致。值得注意的是，Bay K-8644处理后出现了明显的后去极化延迟（delayedafter-depolarizations，DADs）（图5c），代表肌浆网Ca2+含量超载，导致Ca2+释放和内向电流的瞬时激活。自主搏动的iPSC-CM共培养球体被检测到的EFP信号不如阻抗信号强（约为阻抗成功率的50％）。EFP记录过程中主动收缩力和球体运动的影响尚不清楚，但场电位持续时间（fieldpotential  duration,  FPD）参数的药理调节已明确建立。加入金-铁氧化物纳米粒子对EFP没有明显影响。基础条件下，在接种后第7天到第20天之间，共从12个传感器板中的四个独立批次中的1037个iPSC-CM共培养球体进行定量了EFP和阻抗节拍检测（图5d）。iPSC-CM共培养球体的搏动率随培养时间降低，并且12天后FPD数据的分散性也增加。所有传感器板的搏动速率和FPD的平均变异率（％CV）值分别为8％和10％。

图5自主搏动的iPSC-CM共培养球的细胞外电位EFP检测。(a)对照。(b)100  nM维拉帕米处理。(c)1 μM  Bay-K8644处理。FPD长度以及DAD变化都很明显。数据来源于接种后7-20天12个独立记录板中的1037个成纤维细胞共培养球，检测EFP和阻抗，表明基线FPD和搏动率都比较显著。

iPSC-CM和共培养球体的复极机制不同

       与单独培养的iPSC-CM相比，与小鼠成纤维细胞（MEF）共培养会降低共培养球体的搏动率并略微增加场电位持续时间（fieldpotential  duration, FPD）（BR：41.3±4.7 bpm vs 52.9±6.4 bpm; FPD：0.53±0.06 s vs  0.50±0.07 s）。在短时间内（3-10分钟）使用的空载体，30nM E-4031（hERG通道抑制剂）或100 µM BaCl2（几个K+通道的抑制剂，包括Kir2.1）处理发现，共培养球体对E-4031的反应具有时间依赖性且易造成心律失常。在发生心律失常之前，   E-4031短时（3分钟）分别处理单独培养的iPSC-CM和共培养球体产生的效应类似，并且FPD升高（图6），与其他研究一致。在单独培养的iPSC-CM中，FPD与搏动速率之间的线性关系保持不变，这表明与速率校正后的FPD的偏差与心律失常的发生相吻合。在共培养球体中，FPD明显偏离了节律丧失前的基线关系。这与加入BaCl2（3分钟）的反应形成鲜明对比，BaCl2反应在MEF共培养球体中通过增加BR和FPD尺寸而明显不同（图6）。共培养球状体中的BaCl2是增加搏动节律的unique条件。此外，BaCl2的这些作用在原代培养的人心脏成纤维细胞共培养球体（SUPL）中也很明显。

图6 iPSC-CM单独培养和与成纤维细胞共培养的复极化机制。分别用30nM E-4301(绿色)、100 μM BaCl2(红色)、DMSO对照(蓝色)处理后，单独iPSC-CM球(iPSC-CM，实心)和共培养球(CM+Fb,空心)的FPD与搏动率比较。(a)平均数据。(b) E-4301 散点图。(c)BaCl2散点图。BaCl2处理后仅有iPSC-CM单独培养细胞球搏动率显著升高，表明不同细胞球中的离子通道表达可能有差异。

总结

       本研究分析了1000多个iPSC-CM共培养球体，实现无标签测量其收缩性和EFP。结合使用声学测量和自动处理平台（CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH），开发出了高效配药方法。这些方法适用于对iPSC-CM的3D共培养表型分析，能够实现高通量处理复杂情况下的iPSC-CM成熟度相关的特征分析。为验证该方法的有效性和可扩展性，研究人员证明了iPSC-CM与不同来源的成纤维细胞的球状共培养在某些条件下将其搏动幅度提高了一个数量级。通过降低肌膜Ca2+浓度和电起搏来控制搏动频率，可以使iPSC-CM通常不存在的正性肌力反应出现，并且在不同机制的正性肌力药物作用下也可以看到相同效果。最后，与共培养细胞球体相比，iPSC-CM动作电位复极化显然涉及到不同的离子通道, 包括不同于E-4031反应的BaCl2敏感部分。这些结果清楚表明，iPSC-CM在表型上对3D共培养的球体环境有典型的反应，并且该系统提供了其他优化处理手段（例如细胞类型、长期光遗传学或电起搏、细胞外基质等）。这种新颖并且简单的研究方法能够覆盖iPSC-CM生理学的多个成熟度相关的检测分析，并促进了球体共培养模型的进一步开发，该方法可应用于疾病建模，iPSC分化，心血管zhiliao领域或药物安全性验证等领域。

参考文献：

A  Scalable ApproachReveals Functional Responses of iPSC Cardiomyocyte 3D  Spheroids. SLAS Discovery, DOI：10.1177/2472555220975332.