蛋白层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，直径加大，洗脱液体体积增加，样品稀释度大。

 

　　分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床要有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20－30厘米，柱高与直径的比较5：1─10：1，凝胶床体积为样品溶液体积的4－10倍。分级分离时柱高与直径之线为20：1─100：1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。

 

　　蛋白层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在准确分离时，死体积不能超过总床体积的1／1000。

 

　　始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失。

 

　　要很注意的是，各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。装柱要均匀，既不过松，也不过紧，要在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。