1、测定原理

含挥发性脂肪酸的样液，在加热的条件下，与酸性乙二醇作用生成酯，此酯与羧胺反应，形成氧肟酸。在高铁试剂存在下，氧肟酸转化为高铁氧肟酸的棕红色络合物，其颜色的深浅在一个较大的范围内与反应初始物——挥发性脂肪酸的含量成正比，故可用比色法测定。

2、测定方法

⑴ 试剂
① 1：1硫酸：浓硫酸（相对密度1.84，C.P.）加到同体积蒸馏水中稀释配制。
② 酸性乙二醇试剂：取30.0mL乙二醇(C.P.)与4.0mL配制的稀硫酸混合。
③ 4.5mol/L的氢氧化钠：称取180g氢氧化钠(C.P.)溶于水中，冷后以蒸馏水稀释至1L。
④ 10%硫酸羟胺溶液：称取硫酸羟胺(C.P.)10.0g，溶于100mL蒸馏水中。
⑤ 羟胺试剂：量取20.0 mL4.5mol/L的氢氧化钠，与5.0mL10%的硫酸羟胺相混合。
⑥ 酸性氯化铁试剂：将20.0g分析纯FeCl_{3 ·}6H₂O溶于500mL水中，准确加入20.0 mL浓硫酸，并以蒸馏水稀释至1L。
⑵ 测定程序
① 乙酸标准液的配制。精确称取乙酸（分析纯，相对密度1.045，含量99.0%）1.010g，以蒸馏水稀释至100mL，此溶液含乙酸10mg/mL。
准确吸取10 mg/mL乙酸标准溶液1.0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL、25.0mL、30.0mL，分别置于100.0mL容量瓶内，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得100μL/L、500μL/L、1000μL/L、1500μL/L、2000μL/L、2500μL/L、3000μL/L的乙酸标准系列液。
② 标准曲线的绘制。取相对密度1.045的乙酸（分析纯）试剂，制成50mL/L、100 mL/L、500 mL/L、1000 mL/L、1500 mL/L、2500 mL/L、3000 mL/L的系列标准液，分别吸取0.5 mL分置于试管中（12.5cm×1.5cm），每瓶中准确加入，于沸水浴中加热3min，然后立即以冷水冷却；再加入2.5mL羟胺试剂，充分摇匀，然后，充分振荡混匀，以蒸馏水定容，用721型分光光度计以500nm波长测定其光密度，绘制标准曲线，以横坐标表示浓度值，纵坐标表示光密度值。
③ 样品的测定。以4000～10000r/min的离心条件，制取沼气发酵样品澄清液，吸取0.5mL样液置于试管中（12.5cm×1.5cm），准确加入1.7 mL酸性乙二醇试剂，充分混合，于沸水浴中加热3min，应避免试管与加热器壁直接接触。然后立即将试管置于冷水中冷却。加入2.5mL羟胺试剂，并混匀，放置1min，然后全部倒进盛有10mL酸性氯化铁试剂的25mL容量瓶中，用蒸馏水定容，并充分摇匀，静置5min，用分光光度计以500nm波长测定光密度。同样操作做空白试验1份。       计算