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辅酶ⅠNAD(H)含量微量法检测试剂盒
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2022-04-20上海市
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产品简介
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详细信息
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【友情提示】：本产品仅供科研研究使用，不得用于人体临床直接检测。避免给您带来不必要的损失，请仔细阅读购买说明！
| 产品名称 | 规格 | 检测方法 | 货号 |
| 辅酶ⅠNAD(H)含量微量法检测试剂盒 | 100管/48样 | 微量法 | GOY-01S6321 |
商品介绍
| 测定意义 辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。 测定原理 分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570nm下检测吸光值；而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。 需自备的仪器和用品 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 |
试剂的组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 200μL×1 支，4℃保存；
试剂三：液体 4mL×1 瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×2 瓶，4℃保存。
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、低温离心机、移液器、研钵、冰和蒸馏水
四、超氧化物歧化酶（SOD）的测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验
样本和试剂浪费！
1、样本制备
① 组织样本：
取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.25g），加入 1mL 提取液，在 4ºC 或冰浴进行
匀浆(或使用各类常见匀浆器)。4ºC×12000rpm 离心 10min，取上清作为待测液。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取
② 细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL
提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；
12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10
4）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
注意事项：
1、试剂二为酶，不可冷冻，使用时在冰上放置。
2、对照管只需要做一管。
3、若对照管吸光值大于 1，建议将试剂二用蒸馏水稀释 7 倍后使用（10μL 试剂二原液+60μL蒸馏水）。
4、SOD为什么有的样本测定管大于对照管，对照管数值在什么范围？对照管的范围是 0.4-1。对照管吸光值过低可能是（1）试剂二或试剂四没有现配现用；
（2)没有按顺序加试剂；（3）反应时间不够，可以延长反应时间（反应时间 30min可以延长到 40min）。对照管吸光值过高可能是试剂二未按操作说明书稀释相应倍数。
若出现测定管大于对照管，可能是样本中杂质的影响太大，为了降低杂质的影响一般
将样本提取上清液用蒸馏水或提取液稀释 10倍后再测，通常可以使测定正常。
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测定步骤：
1、 酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm。
2、 试剂三的稀释：将试剂三用蒸馏水稀释50倍，用多少配多少。（试剂三和蒸馏水1：49稀释。
3、 工作液配制：在试剂一加入100μl试剂二，充分混匀。配好的试剂4℃避光可保存一周。（若一次性测定样本较少，可按照实际用量将试剂一和试剂二按照20ml：0.1ml的比例混匀配制）
4、 将一瓶试剂四用5ml蒸馏水溶解（溶解后一周内用完）。
5、 样本测定（在96孔板中依次加入下列试剂）
选择抗凝的注意点：
①、每一份样本所加的抗凝剂的量要一致，同时所取的全血的量也要尽量一致;
②、收集抗凝全血后一定要轻轻颠倒，充分抗凝，防止部分血液未接触到抗凝剂而导致凝固;
③、抗凝全血收集的血浆相对较多（1ml抗凝全血能分离出0.4～0.5ml血浆）;
④、抗凝收集的血浆冷冻保存后，解冻时可能会出现絮状浑浊，如有则需要离心去掉浑浊后用于测定。
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