EMSA凝胶阻滞-DAP-seq

EMSA凝胶阻滞-DAP-seq

EMSA凝胶/电泳迁移率实验技术服务常见问题

1、EMSA原理及方法

EMSA 称凝聚阻滞实验或凝胶电泳迁移率检测， 是一种用于研究转录因子和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术， 能对各类转录因子的 DNA 结合活性进行定性和半定量分析，是一项研究细胞信号转导通路的关键实验技术。

EMSA 主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针有互作。

2、看不到迁移条带

1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。

2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。

3）探针与蛋白无特异性的相互作用。

4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。

5）曝光或者成像时间过短。

6) 在 Super-Shift EMSA 测定中看不到 Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因：

a. 抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于 Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于 Super-Shift EMSA。

b. 测定的活化的 DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到 Super-Shift 的带，也看不到 DNA/蛋白复合物的量的减少。

c. 使用的抗体过度稀释。一般 10～20 ul 的反应液需要使用 0.5～1 ul 原倍的抗体。

d. 多抗与 DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到 Super-Shift 的带，但应当可以看到 DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。

3、实验背景高

1）曝光或者成像时间过长。

2）封闭时间不足或者效率不高。

3）洗涤效果不佳。

4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。

5）蛋白的质量不高，杂质多

4、EMSA如何设置对照实验及其目的

EMSA实验会有如下对照组：
(1)阴性对照反应(标记探针)；
(2)常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)；
(3)探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记探针)；
(4)突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记突变探针)；
(5)Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋目的转录因子的特异抗体)。

每个对照组的目的：
(1)确定探针里面是否有杂质，光有探针，没有其他成分时，探针的位置，应该位于下方。
(2)这个是看蛋白和探针的结合，是实验目的
(3)看探针结合的特异性。如果冷探针可以竞争结合，阻碍了标记的探针，说明2中的结合是特异的
(4)目的和3相同。突变的冷探针应该对2的结果没有影响
(5)也是判断特异性，这次是看蛋白的特异性，和抗体结合后，就会有super-shift。如果没有，说明是其他的蛋白结合。

5、EMSA非放射性探针设计注意事项

（1）EMSA探针不宜太长，一般是几十碱基对。太长会产生过多结合位点导致结果分析困难，还会产生超级螺旋结构而掩盖结合部位

（2）注意AT/GC比例

（3）防止产生空间位阻

（4）防止错位配对、封闭成环，排除目标序列以外结合位点

（5）推荐Biotin或红外荧光标记，尽量不要用DIG标记。