《低温乳制品中沙门氏菌检验 实时荧光PCR方法》征求意见
- 2021/10/1 8:20:54 23914
- 来源：仪表网
【仪表网 仪表标准】《低温乳制品中沙门氏菌检验 实时荧光PCR方法》团体标准已完成征求意见稿的编制，根据《团体标准管理规定》的要求，为保证标准的科学性、严谨性和可操作性，现在《全国团体标准信息平台》面向社会各界公开征求意见。
本标准规定了巴氏杀菌乳、高温杀菌乳(低温保存)、发酵乳、调制乳及奶油等低温乳制品中沙门氏菌的实时荧光 PCR 检测法(商品化试剂盒方法)。
本标准引用的文件包括：GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物检验总则；GB 4789.4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验；GB 4789.28 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求；GB 19489 实验室 生物安全通用要求；GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检验；SN/T 2415-2010 进出口乳及乳制品中沙门氏菌快速检测方法 实时荧光 PCR 法。
仪器和设备：
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备如下：1.恒温培养箱:36 ℃±1 ℃；2.电子天平:感量 0.1g；3.均质器(旋刀或拍击式)或等效设备；4.pH 计或精密 pH 试纸:精密度 0.1；5.微量移液器及无菌带滤芯吸头；6.干浴加热器:98 ℃±1 ℃；7.掌式离心机；8.实时荧光定量 PCR 仪；9.低温冰箱。
样品制备及增菌培养：
将样品恢复至室温，无菌操作称取 25 g(mL)样品，置于盛有 225 mL MicroFast®️沙门氏菌快速增菌培养基(培养基应在煮沸后降温至 40 ℃左右时使用)的无菌均质袋或其他无菌容器中，若样品是固 态或半固态，用拍击式均质器拍打1 min ~2 min混匀(或用旋转式均质器8000 rpm ~10000 rpm均质1 min~2 min)；若样品是液态，不需要均质，震荡混匀即可。如需调整 pH，用 1 mol/mL NaOH 或 HCl 调整pH 至 6.8±0.2，如使用均质袋，可直接进行培养；如使用均质杯或其他容器，无菌操作将样品转移到其他培养容器内于 36 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h。
体系配置：
MicroFast®️沙门氏菌核酸检测试剂盒的 PCR 反应体系为预分装的体系，每个 0.2 mL 的 PCR 管中都含有除模板外的沙门氏菌引物探针及其他需要的 PCR 反应成分。使用前从冰箱或冰柜中取出分装的预混液，待预混液融化后，使用掌式离心机离心 5 s ~10 s 后，打开 PCR 管盖，向其中加入 5 μL 模板(空 白对照、阴性对照、样品增菌液提取的核酸、阳性对照)，盖好管盖，使用掌式离心机离心 5 s ~10 s，即可上机检测。
结果判定：
质控系统：空白对照和阴性对照均未出现典型的扩增曲线或 Ct 值≥40，阳性对照出现典型的扩增曲线并且 Ct 值<30，则检测系统正常。否则，任一种对照出现非上述正常结果，应重做实验，同时排 除污染。
检测系统正常的情况下，检测样品 Ct 值≤35 时，判定 PCR 结果为阳性；当 35<检测样品 Ct 值<40 时，重复检测一次，如果 Ct 值<40 并且曲线有明显的对数增长期，判定 PCR 结果为阳性，否则判定 PCR 结果为阴性；当 Ct 值≥40 或无 Ct 值时，判定 PCR 结果为阴性。
如果 PCR 结果为阴性，则直接报告阴性结果。如果 PCR 结果为阳性，则需要根据 7.3 进行阳性确证实验。
本标准适用于巴氏杀菌乳、高温杀菌乳(低温保存)、发酵乳、调制乳及奶油等低温乳制品中沙门氏菌的快速初筛及鉴定。
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