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【产品名称】RNA恒温快速扩增试剂盒（试纸条型）-III【包装规格】

货号：WLRN8211KIT
规格：48份/盒
【原理概述】
本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下（一般为39 ºC~42 ºC），反转录酶利用特异性引物和模板RNA合成cDNA链，在辅助蛋白和单链结合蛋白的帮助下，重组酶和引物形成复合体；进行同源搜索并结合目的同源域，此时在该同源位置形成D-loop区并开始进行链交换；伴随着重组酶从复合体上解离，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸。依赖核酸酶的作用，加入根据模板设计的特异的分子探针，使用胶体金技术（三明治夹心法）可以对最终结果进行检测。
【产品特点】
本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需15 min）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。
本试剂对设备要求低，金属浴、水浴锅等即可进行反应操作，无需购买PCR扩增仪等价格高昂的专属设备。
【引物设计】
建议使用长度在30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；下游引物的5’端标记一个修饰基团（常用）。引物设计避免形成二级结构而影响扩增；扩增子长度建议在150-500 bp。
【荧光探针设计】
在上下游引物中间，设计一段长度为46-52nt
与目的片段互补的序列；5’端修饰一个抗原标记（典型FAM）；在5’端和3’末端的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为核酸酶的识别位点；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer等。
【试剂盒组成】
组成 含量
A buffer 1.6 mL×1管
B buffer 150 μL×1管
试剂 48份
使用说明书 1份
注：考虑到核酸降解问题，RNA系列产品暂未提供正对照模板和引物探针。
【试剂盒储存】
1．储存条件：储存温度 ≤ -20 °C恒温环境，避光保存，避免重压；
2．产品有效期：14个月；
3．生产日期见外包装。
【操作步骤】
提前将试剂盒液体组分取出，室温融化，震荡混匀。
(1)每个干粉反应管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需融化混匀，否则会对实验效果产生影响）；
(2)每个反应管分别加入2 μL上游引物、 2 μL下游引物和0.6 μL探针（引物和探针浓度为10 μM，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中）；
(3)向反应管中依次加入5 μL 核酸模板和8.5 μL ddH2O （也可根据实际需求调整加入模板的体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为13.5 μL）；
(4)最后向反应管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（注意：a. B buffer是启动反应的缓冲液，一旦进入体系意味着酶被激活；b. 请务必以上下颠倒甩动反应管8-10次的方式进行混匀，涡旋、弹管子等方式可能无法有效混匀；c. 对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧，盖好后上下颠倒后混匀，可保证反应同时启动）；
(5)混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中40-42 ºC孵育15min~20min；
(6)反应结束后，用ddH2O将扩增产物稀释10～20倍，混合均匀后，进行试纸条显色，5 min内观察质控线与检测线判读结果。
体系配制
组分 体积（μL）
A buffer 29.4
上游引物(10 μM) 2
下游引物(10 μM) 2
探针(10 μM) 0.6
ddH2O和核酸模板 13.5
B buffer 2.5
总体积 50
【注意事项】
1.使用前请仔细阅读说明书，严格按照操作步骤进行操作；
2.样品处理应该严格按照生物安全规范操作，在进行反应时请注意避免核酸污染，并设置空白对照；
3.使用时请取出实验所需的MIRA反应单元的数量，剩余部分请置于存储条件下；
4.使用有效期内试剂，且各组分不得与其他批号的相应成分混用。