（货号：WLRE5003）

原理概述：

本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，特殊修饰的反转录酶利用特异性引物DNA和模板RNA合成cDNA链，反应体系中的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA链为模板进行快速核酸扩增反应。本试剂盒在42 ºC下，依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备能实现对目标片段扩增过程的实时监控。适用于实验室级别的RNA扩增以及其他检测用途的RNA扩增使用。

引物设计：

建议使用长度在30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；引物设计避免形成二级结构而影响扩增；扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。

荧光探针设计：

探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有四个修饰位点：距离5’端的≥35 nt的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个粹灭基团，两个基团的间距为2-4 nt；THF距离3’末端≥15 nt，并且3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer。

试剂盒组成：

100T/盒

试剂盒储存：

运输条件：低温运输；

储存条件：储存温度 ≤ -20 ºC，避光保存，避免重压、反复冻融；

操作步骤：提前将试剂盒所需组分取出，冰上或低温下融化（C buffer可室温融化），震荡混匀。

1) 向无菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer；

2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探针，再加入1.5μL dNTPs(10 mM)；

3) 向反应管中加入12 μL P-core和0.6 μL E-core，（步骤1~3可以混合后再分装至反应管中）；

4) 向反应管中加入3.8 μL核酸模板；

5) 最后向反应管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（加入B buffer反应立即被启动）；混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中。荧光检测程序设置为：恒温42 ºC；每30 s采集一次荧光信号；反应时间20 mins。

注：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。

体系配制

注意事项：

• 为保证液体试剂组分活性，请保证储存温度 ≤ -20 ºC；试剂使用时请保持低温，避免高温放置过长时间；
• 在进行反应时请注意避免微量核酸染，并设置空白对照实验组。