糖化血红蛋白HbA1 c的构成

 ● 糖化血红蛋白(Hemoglobin， Hb) 是指血糖和红细胞中的血红蛋白之间形成的非酶促的蛋白糖化反应物。

 ●总血红蛋白可以分为A，A2，F三种组分，其中F主要在胎儿期，而成人主要为A，是由两个a链和两个β链构成。A2由两个a链和两个δ链形成，F由两个a链和两个y链形成。

●成人HbA占97%， 又可分为HbA0和HbA1两种，HbA0为没有被糖基化部分，而HbA1为被糖基化部分。

●正常人维持一定的血糖水平，即会形成正常范围内的HbA1,其中HbA1c为主要组分，HbA1a和HbA1b的 含量则非常低。所以在反映血糖水平时主要用HbA1c来表示。

 ●正常人平均HbA1c水 平约为5%。总HbA1约占6%左右，而HbA1a和HbA1b总和尚低于1%。

糖化血红蛋白HPLC检测方法-金标准

● 目前HPLC法测定HbA1c使其准确性和重复性得到很大的提高。

●美国临床化学协(AACC)糖化血红蛋白标准化分会和IFCCHbA1C标准化工作组建议，以DCCT研究中所"的方法”-HPLC方法作为检测糖化血红蛋白的金标准，希望以此使大多数的实验方法能够参照“的方法”实现标准化。

●1993年美国1型糖尿病控制及并发症实验( DCCT)和英国大规模的2型糖尿病控制与并发症关系研究(UKPDS)的研究中把HbA1c作为糖尿病控制的一-个观察指标。

●1996年4月起在日本，HbA1c被纳入老年人保健法中糖尿病筛选的检查项目。

●2002年美国糖尿病协会(ADA)已将其作为监测糖尿病控制的金标准对其应用也作了明确的规定:即所有糖尿病患者均应常规测定HbA1c。其初诊时测定结果为基线时的代谢状况，此后的测定值则作为糖尿病*治疗控制中的一部分， 这样在提高糖尿病诊断水平、血糖控制、慢性并发症的防治中具有十分重要的应用价值

填料描述

Target-Gly填料基质为聚苯乙烯-二乙烯苯(PS/DVB)球形颗粒。运用特殊的化学键合技术， 将离子交换功能基团 均匀细密地键合在聚合物亲水层的表面。

填料稳定性

由于 PS/DVB 的表面修饰是*基于化学键键合，所以Target-Gly离子交换填料具有优异的稳定性。 该固定相能够 与大多数缓冲液如醋酸铵、磷酸盐、Tris 等相容。在 pH 6.0时以 20mM磷酸盐缓冲溶液为流动相运行Target-Gly色谱柱，柱效几乎没有变化。

流动相兼容性

与水溶液，水与乙腈、丙酮或甲醇的混合物等相容。典型的缓冲液包括磷酸盐、Tris和醋酸盐等。

流速

内径为3.0-4.6mm的色谱柱典型操作流速为0.40-1.0mL/min。

安全注意事项

 离子交换柱通常在高压下运行。如果管路连接不紧，将会导致有机溶剂和注入样品的泄漏，从而对操作人员的健康产生影响。一旦发生泄漏，应佩戴适当的手套进行处理。另外当打开色谱柱时还应采取适当的保护措施，以防止微小的高分子颗粒进入呼吸道。

色谱柱安装与操作

色谱柱在运输过程中或在没有使用时，它的两端总是用堵头进行密封。当将色谱柱接入色谱仪器系统时，首先移去两端的堵头。请注意将流动相流动的方向与柱上标记的方向保持一致。除非出于特殊考虑，例如为了清除堵在色谱柱入口端的脏污等而需要将色谱柱反接以进行冲洗时，建议用户在接上色谱柱时一定要遵循柱上标记的方向。由于色谱柱的连接是整个色谱操作过程的一部分，如果密封卡套过紧或安装不合适，或者密封卡套与色谱柱端口不匹配，都有可能导致溶液的泄漏。请按照下面步骤将色谱柱与密封卡套相连接，从而将色谱柱接入 HPLC 系统：

（1）di一次使用的管线，请依次将管线接头和密封卡套装在外径 1/16”的管线上。密封卡套的宽口端应朝向管线接头。

（2）将管线紧紧插入色谱柱的接口，向前滑动密封卡套和管线接头，并使管线接头的螺纹与色谱柱端口的螺纹相互衔接，然后拧紧管线接头。如果管线为高分子材料，请转到步骤（4）；如果是金属管线，请继续（3）。

（3）在用力将管线压入柱端接口之后，用 1/4”扳手将已拧紧的螺帽再进一步紧固。

 （4）对色谱柱的另一端采用上述方法进行操作。

样品与流动相

       为了避免色谱柱的堵塞，所有样品和溶剂，包括缓冲溶液在内，都必须在使用前用 0.45m 或 0.2m 的滤膜 过滤。 建议使用预柱滤片（0.5m孔径）或保护柱来保护色谱柱。Target-Gly 色谱柱可以使用水溶液， 或者有机 溶剂 （如甲醇、乙腈）与水的混合物等来作为流动相。典型的流动相中含有磷酸、醋酸或 Tris 的钠盐或钾盐。 流动相在使用 前需要脱气。一个简单的脱气方法是将流动相在由水泵形成的真空下超声 5min。

色谱柱的使用

1）新的Target-Gly 色谱柱的运输溶剂是 20mM 磷酸盐缓冲液（pH 6.0）。在储存和运输过程中， 填料可能会干涸。 第_一 次使用时，建议用 10-20 倍柱体积的运输溶剂进行冲洗以活化色谱柱。 接着可用用户自己选择的流动相冲洗色谱柱 进行平衡。 流速由0.1mL/min 逐渐升至所需的操作条件，直至基线稳定为止。 如果柱压和基线波动较大，这可能是 气泡进入了色谱柱中。这时可用较高流速冲洗色谱柱 3-10 分钟，例如 4.0*33mm的色谱柱可采用流速 1.5-2.0mL/min。 如果 流动相的类型或 pH与色谱柱中的储存溶剂差异较大，建议将色谱柱先用新的流动相冲洗 10 倍柱体积。

2）为了获得*的分离 效果和延长柱的使用寿命， 请尽量使用 pH 在 2-10 范围内的流动相。

3）正常的操作压力应当低于3,500psi

4）zui高操作温度为 80℃。为了延长柱的使用寿命，请尽量在60℃范围内操作。

5）*不用时，Target-Gly色谱柱应保存在含 0.1%NaN3 的 20mM 磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中。色谱柱需要用 储存缓 冲溶液冲洗至少20倍柱体积。然后再用随色谱柱附上的两个可拆卸的堵头塞紧色谱柱的两端以防止柱床的干涸。

色谱柱的清洗

      在使用过程中，样品经常会被吸附在柱入口端的筛板或者填料上。当样品吸附累积到一定程度时，柱压将会升高，色谱峰形也会出现展宽。这时就需要清洗色谱柱了。下面是色谱柱清洗的基本步骤：

1）将色谱柱与检测器断开；

2）将色谱柱反接后进行冲洗；

3）将流速设置到所*的zui大流速的 50%进行冲洗。注意柱压的变化。如果柱压超出正常水平许多， 则需要降低 流速， 或选用低粘度的清洗溶液；

4）通常 10-15 倍柱体积的清洗溶液就足够了。低 pH 的盐溶液有助于去除碱性蛋白。 高 pH 的盐溶液有助于去除酸性 蛋白。 有机溶剂可去除疏水蛋白。Target-Gly色谱柱清洗溶液为含 1.0M NaCl pH10的50mM 磷酸盐缓冲液.

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