| 问题 | 可能原因 | 验证或解决办法 |
| 背景较高 | 封闭不充分 | 延长封闭时间，更换合适的封闭剂(脱脂奶粉，BSA,血清等) |
| 一抗浓度过高 | 增加一抗稀释倍数， | |
| 抗体孵育温度过偏高 | 建议4℃孵育 | |
| 二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应 | 设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度 | |
| 一抗或二抗与封闭剂有交叉反应 | 在孵育和洗涤液中加入Tween-20以减少交叉反应. | |
| 洗膜不充分 | 增加洗涤次数 | |
| 膜不合适 | NC膜比PVDF膜背景低 | |
| 膜干燥 | 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 | |
| 没有阳性条带 或很弱 | 一抗、二抗等不匹配 | 订购试剂时认真选取一抗与组织种属， 一抗与二抗或/和底物与酶 系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参可以验证二级检测 系统的有效性。 |
| -抗或/和二抗浓度低 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 | |
| 封闭剂与一抗或二抗有交叉反应 | 封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20,或更换封闭剂(常用的 脱脂奶、BSA、血清或明胶 | |
| 一抗不识别目的物种的靶蛋白 | 检查说明书，或做ClustalW比对，设阳性对照 | |
| 样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过 低(抗原无效) | 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中 不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加标本上样量至少每孔 20-30ug蛋白，样本制备时使用蛋白酶抑制剂，或分级提取目的蛋白。 | |
| 转膜不充分，或洗膜过度 | 使用丽春红S检测转膜效果，PVDF膜需浸透，需正确的转膜操作，勿 过度洗膜 | |
| 过度封闭 | 使用含0.5%脱脂奶或无脱脂奶的抗体稀释液，或更换封闭剂，减少 封闭时间 | |
| 一抗失效 | 使用有效期内抗体，分装保存，避免反复冻融取用，工作液现配现用 | |
| 二抗受叠氮钠抑制 | 所用溶液和容器中避免含有叠氮钠(HRP的抑制剂) | |
| 酶和底物失效 | 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了、选择在有 效期内、有活性的酶联物，使用新鲜的底物. | |
| 曝光时间过短 | 延长曝光时间 | |
| 多非特异性条 带 或条带位置不 对 | 细胞传代次数过多，使其蛋白表 达模式的分化 | 使用原始或传代少的细胞株，或平行实验 |
| 体内表达的蛋白样本具有多种修 饰形式：乙酰化、磷酸化、甲基 化、烷基化、糖基化等 | 查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小 | |
| 蛋白样本降解 | 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 | |
| 新蛋白或同族蛋白的分享同种表 位的不同剪接方式 | 查其它文献报导，或BLAST搜寻，使用说明书报导的细胞株或组织 | |
| 一抗浓度过高 | 降低抗体浓度，可以减少非特异性条带 | |
| 二抗浓度过高产生非特异性结合 | 降低抗体浓度，增加二抗对照 选择特异性更强，只针对重链的二抗 | |
| 抗体未纯化 | 使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带 | |
| 蛋白存在二聚体或多聚体 | SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10 min, |
| 以增强蛋白质解聚变性 | ||
| 背景有白色/黑 色斑点 | 转膜时有气泡或抗体分布不均 | 尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动 |
| 抗体与封闭剂结合 | 过滤封闭剂 | |
| 暗片现白条带 | 一抗或二抗加入过多 | 稀释抗体的浓度 |
| 目的条带过低/ 过高 | SDS-PAGE胶浓度选择不合适 | 调整胶浓度，分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓 度胶 |
| “微笑”条带 | 迁移过快，电泳温度过高 | 降低电泳速度，低温电泳(冷室) |
| 转膜不充分 | 膜没有均匀湿透 | 使用99%methanol漫透膜 |
| 靶蛋白分子量小于10,000 | 选择小孔径的膜，缩短转移时间 | |
| 靶蛋白等电点等于或接近转移缓 冲液pH值 | |可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液(pH10.5)或使用低pH值缓 冲液如乙酸缓冲液 | |
| 甲醇浓度过高 | 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同 时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇 浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 | |
| 转移时间不够Thick gel | 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 |
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