技术文章

iTRAQ（Isobaric tags for relative and absolute quantitation）技术是由美国应用生物系统公司ABI研发的一种多肽体外标记技术。iTRAQ技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较最多10种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。

原理简介

iTRAQ技术采用4种或8种同位素编码的标签，通过对氨基酸N端和赖氨酸残基进行酶解后用iTRAQ试剂进行特异性标记，而后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量。

iTRAQ试剂包括3个部分：报告基团（Report group）、平衡基团（Balance group）和肽反应基团（Amine-specific reactive group）。报告基团相对分子质量为113-121Da（无120），因此iTRAQ试剂可同时标记8组样品。平衡基团相对分子质量为192-184Da（无185），使得八种iTRAQ试剂分子量均为305Da，保证标记的同一肽段质荷比（m/z）相同。肽反应基团将iTRAQ试剂与肽段的N端及赖氨酸的氨基特异结合，在其上报告基团通过平衡基团与反应基团相连，形成等量异位标签。

在串联质谱中，来自不同样品的同一肽段由于是等质量的，在一级质谱检测（MS1）中表现为一个母离子峰（即同一个质谱峰），在二级质谱检测（MS2）中进一步碎裂时，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，质量平衡基团丢失，报告基团则会产生相应的不同质量数的报告离子，它们各自质谱峰的信号强弱，代表着来源于不同样品的该肽段及其所对应的蛋白的表达量的高低。因此，根据报告离子的信号强度值即可获得样品间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。同时，多肽内的酰胺键断裂，形成一系列b离子和y离子，得到离子片段的质量数，通过数据库查询和比较，可以鉴定出相应的蛋白质前体。

实验流程

蛋白提取和质控——iTRAQ标记肽段——HPLC分级——质谱分析——数据库处理——生物信息学分析

图1 iTRAQ实验流程图。

TMT（Tandem Mass Tag）技术是由美国Thermo Scientific公司研发的一种多肽体外标记技术。与iTRAQ技术原理相同，优势类似，但是比iTRAQ拥有更多的标签数，能一次上机更多样品。

原理简介

TMT技术采用2种、6种、10种或16种同位素标签，特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，监测碎裂下来的标签实现肽段定量。一次实验可同时比较最多16组不同样品中蛋白质的相对含量。

TMT标签由三部分组成：分子量报告子（报告基团）、分子量标准化部分（平衡基团）和（肽）反应基团，形成2种、6种、10种或16种相对分子质量均为等量的异位标签。TMT试剂通过反应基团与肽段上赖氨酸及N端氨基酸残基相连，能够高效地标记酶解后的肽段。在一级质谱中，分子量标准化部分使任何一种TMT试剂标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比。在二级质谱中，释放出分子量报告子。每个报告子都有各自du特的分子量，产生不同的报告离子峰，其强度反应了该肽段在不同样品中的相对表达量信息，另外二级质谱中的肽段碎片离子峰质荷比反应了该肽段的序列信息，根据这些质谱原始数据可得到蛋白质的定性和相对定量信息。

实验流程

蛋白提取和质控——TMT标记肽段——HPLC分级——质谱分析——数据库处理——生物信息学分析

SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC)。SILAC是一种通过使用13C-葡萄糖、15NH或3C标记氨基酸的培养基引入稳定同位素，标记细胞或小生物体内的蛋白并根据质谱丰度比率进行定量的体内代谢标记技术。

最初SILAC使用的标记氨基酸是氚代jia硫an酸和氘代甘an酸，目前常用的标记氨基酸有亮an酸、精an酸、赖氨酸、甲硫an酸和酪an酸等。

原理简介

在细胞培养基中加入天然同位素（轻型）或稳定同位素（重型）标记的必需氨基酸，替代细胞培养基中相应的氨基酸，细胞经若干传代后，稳定同位素标记的氨基酸wan全掺入到细胞新合成的蛋白质中，取代了原有的氨基酸。这样，两个蛋白之间就存在分子量的改变，而其它化学性质无异。然后将两组细胞混合，提取蛋白质，经分离纯化后进行质谱测定。

每个肽段作为质谱中的一对：低分子量的肽段含有轻型氨基酸，来源于A组，高分子量的肽段则含有重型氨基酸，来源于B组。如果SILAC肽段对呈现1：1的比例，则蛋白质组中此蛋白的丰度无差异。如果含有重型氨基酸的肽段峰强度偏高，则说明B组中蛋白丰度更高。因为稳定同位素标记的氨基酸与天然氨基酸的化学性质基本相同，除了分子量有差异。因此，质谱上峰强度的比值直接对应了A组与B组的比例，即可对蛋白质进行相对定量。

实验流程

细胞培养标记——蛋白提纯——1:1混合蛋白样品——蛋白还原、酶切——LC-MS液质串联检测——生物信息学分析

图2 SILAC实验流程图。

蛋白质非标记定量技术（Label-free）是经典的定量蛋白质组学技术。该技术无需昂贵的同位素（iTRAQ和TMT）标签做内标，而是通过比较质谱分析次数或质谱峰强度，分析不同来源样品蛋白的数量变化。该方法认为肽段在质谱中被捕获检测的频率与其在混合物中的丰度成正相关，因此蛋白质被质谱检测的计数反映了蛋白质的丰度，通过适当的数学公式可以将质谱检测计数与蛋白质的量联系起来，从而对蛋白质进行定量。

原理简介

Label-free通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，按照其原理主要分为两种，di一种Spectrum counts类的非标记方法，发展比较早，已经形成多种定量算法。其主要的原理是以MS2的鉴定结果为定量基础，各种方法的差别在于后期算法在大规模数据上的修正。第二种非标记定量的原理是以MS1为基础，计算每个肽段的信号强度在LC-MS上的积分（如Maxquant），以积分面积对肽段对应的蛋白质进行相对定量。

实验流程

蛋白提取——蛋白酶解——高效液相HPLC预分离——MS质谱分离——原始数据搜库分析——生物信息学分析

图3 Label-free实验流程图。

DIA（Data-independent acquisition）技术是瑞士苏黎世联邦理工学院的Ruedi Aebersold博士及其团队与AB-SCIEX公司联合研发的一项全新质谱技术，而SWATH（Sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ions）便是基于DIA采集模式的一种新技术。

DIA采集模式将质谱整个全扫描范围分为若干个小窗口，然后依次对每个窗口中的所有离子进行检测、碎裂，使其能够对扫描区间内的所有肽段离子进行高速一级MS扫描，再进行二级MS/MS分析，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的信息，在碎片离子层面完整重现nanoLC的色谱峰图，因此DIA定量可以利用碎片离子随时间的积分来表征肽段含量，而利用二级碎片离子定量不仅可以降低样本检测的缺失值，同时提高定量准确性和重复性，实现大样本队列中高覆盖率，高稳定，高精准的蛋白质组定量分析。但本质上，DIA也是一种Label-free定量方法。

原理简介

DIA/SWATH技术将扫描范围划分为以25 Dalton为间隔的一系列区间，通过超高速扫描来获得扫描范围内全部离子的所有碎片信息。以蛋白质组学样品分析中常见的扫描范围400~1200为例，每25 Dalton作为一个扫描间隔（SWATH），每个SWATH扫描时间设定为100 ms，那么该扫描范围累计需要32个SWATH（1200-400/25=32），完成一次扫描仅需要3.2秒。

与传统的shotgun技术相比，SWATH技术能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂，使用二级碎片离子进行蛋白相对/jue对定量，从而获得完整的肽段信息。

目前SWATH可以根据样品TIC分布进行窗口优化，从而获取更多的谱图信息，提高了精准度和分辨率。通过高分辨高灵敏质谱TripleTOF 5600/+以及zuixin的TripleTOF 6600进行分析扫描。因此，SWATH技术是一种真正全景式的、高通量的质谱技术，同时也解决了shotgun鉴定重复度较低的缺点。

实验流程

蛋白提纯——蛋白还原、酶切——HPLC分离肽段——LC-SWATH模式质谱检测——OpenMS分析质谱数据——生物信息学分析

图4 SWATH实验流程图。