心血管疾病的机制研究一直是生物医学研究的重点领域之一。近年来，随着新技术的不断涌现人们对心血管疾病发生与发展的机制认识不断深化并极大地改善了临床诊疗水平。而对于单心肌细胞兴奋收缩偶联机制以及病理生理状态下心肌收缩舒张功能障碍的研究为我们在细胞学层面理解心肌疾病提供了重要的基础。近期，斯坦福大学的研究者在《European Heart Journal》杂志发表了题为Modelling diastolicdysfunction in induced pluripotent stemcell-derived cardiomyocytes fromhypertrophic cardiomyopathy patients的研究论文，采用了新的视角去探索心脏疾病中心肌细胞的功能与疾病之间的联系。
舒张功能障碍（Diastolic dysfunction，DD）是肥厚型心肌病（HCM）患者的显著临床特征也是导致肥厚型心肌病患者死亡的主要原因，表现为舒张期心室舒张缓慢或不*。HCM患者发生心肌舒张功能障碍的具体细胞学机制尚不*清楚，严重限制了临床治疗效果。
在以往的研究中，人们建立了多种HCM的动物模型(从啮齿动物到大型动物)和疾病诱导方法。但是，由于种属差异，动物模型的研究结果距离临床应用相去较远，急需人源化的研究手段。近年来，采用肥厚型心肌病患者来源的多能干细胞源性心肌细胞（iPSC-CM）在研究舒张功能障碍在肥厚型心肌病中的潜在机制以及新药研发方面具有巨大潜力。
在该研究中，采用了Plexithermo HCell系列单心肌细胞功能检测系统。首先通过外周血单核细胞重编程和诱导分化成功建立了舒张功能障碍的iPSC-CM细胞模型，该模型携带了家族性HCM中zuichang见的三种基因突变（即：肌球蛋白重链7， MYH7、肌球蛋白结合蛋白C3，MYBPC3和心肌肌钙蛋白T2 ，TNNT2)。经过细胞鉴定后进行舒张功能分析。与正常对照组iPSC-CM细胞相比，HCM iPSC-CM 组心肌细胞舒张期肌节长度明显缩短；出现maximum舒张速率降低和舒张时间延长而收缩速率未见变化。
图1：肥厚型心肌病患者来源的多功能干细胞衍生分化心肌细胞出现舒张功能障碍。（A）iPSC-CMs的免疫荧光染色微阵列图像，显示排列的肌节结构。（B和C）采用过表达GFP-actin荧光显示iPSC-CMs肌节，并通过活细胞共聚焦扫描获得肌节收缩舒张图像。（D-G）与正常对照iPSC-CMs组相比，HCM-iPSC-CM组出现舒张期肌节长度缩短（D）、maximum肌节舒张长度（E）不变、maximum舒张速率（F）减慢、90%舒张时间（G）延长。
细胞内钙稳态在心肌细胞兴奋收缩偶联中发挥至关重要的作用，该研究进一步通过Fura-2 AM荧光成像方法发现，与正常对照组iPSC-CM相比，HCM-iPSC-CM在舒张期心肌细胞内[Ca2+] i水平显著升高和出现Ca2+失稳态，且在β-肾上腺素刺激下Ca2+失衡进一步加剧。同步观察心肌细胞内钙瞬变和心肌收缩力结果发现，HCM-iPSC-CM的肌丝具有更强Ca2+敏感性（以dF/Δ[Ca2+]i衡量）。并且，通过CRISPR / Cas9对正常心肌细胞构建TNNT2 R92W突变或者对HCM-iPSC-CM的突变进行修正，均证实了肥厚性心肌病的基因突变可导致心肌出现舒张期钙超载，钙回摄减慢，肌丝钙敏感性增强，最终损害HCM-iPSC-CM的舒张功能。
图2：Fura-2AM荧光指示检测HCM-iPSC-CMs舒张期细胞内Ca2+。与Ctrl-iPSC-CMs相比， HCM-iPSC-CMs舒张期细胞内Ca2+升高（B），Ca2+回摄显著延长（C）。采用kafeiyin诱发钙瞬变发现HCM-iPSC-CMs的SR释放更多的Ca2+，钙瞬变衰减时间延长。
图3：细胞功能成像显示HCM-iPSC-CMs舒张功能障碍。同时记录心肌细胞钙瞬变和细胞收缩应力，与Ctrl-iPSC-CMs相比，HCM-iPSC-CMs的钙瞬变幅值未发生显著变化，但是钙瞬变速率和肌丝钙敏感性均增强。
图4：β-肾上腺素处理加重HCM-iPSC-CMs舒张功能障碍。ISO处理进一步提高了HCM-iPSC-CMs中舒张期细胞内Ca2+浓度，显著延长了钙瞬变衰减时间，加重细胞内Ca2+异常失衡。虽然ISO处理对Ctrl-iPSC-CMs和HCM-iPSC-CMs的收缩节律均有提高，但HCM-iPSC-CMs组中出现更为严重的舒张期肌节长度缩短；舒张速率降低和舒张时间延长。
上述结果表明了Ca2+稳态对HCM-iPSC-CM的舒张功能的重要作用，该研究进而采用Ca2+阻断剂（10–200 nM verapamil 和 10–500 nM diltiazem)和晚期Na+通道阻断剂（1–10 µM ranolazine 和 200nM to 1 µM eleclazine)处理可显著改善HCM-iPSC-CM的心肌舒张功能，表现为缩短舒张期肌节长度，加快舒张速率，减少舒张时间；并显著促进了HCM-iPSC-CM的存活。并且发现，与对照组iPSC-CM相比，HCM iPSC-CM中L型Ca2+通道（LTCC）和瞬时受体电位阳离子通道（TRPC1，3）的表达显著增加，导致TRPC依赖的Ca2+内流增强。这可能是导致HCM-iPSC-CM舒张期钙超载的重要原因。
图5：Ca2+阻断剂和晚期Na+通道阻断剂可改善HCM-iPSC-CMs钙稳态和舒张功能。Ca2+阻断剂和晚期Na+通道阻断剂处理可降低HCM-iPSC-CMs舒张期细胞内Ca2+并缩短钙瞬变；增加舒张期肌节长度和舒张速率，缩短舒张时间。
图6：恢复钙稳态可显著提高长时程β-肾上腺素刺激下的HCM-iPSC-CMs存活率。对HCM-iPSC-CMs中钙稳态调控的关键因子的表达水平进行分析发现Cav1.2,MYH7, NPPA和NPPB表达增加，MYH6,Casq2和Cav3表达降低。CaMKIId自磷酸化（pThr286）较Ctrl-iPSC-CMs明显增强。通过Ca2+阻断剂和晚期Na+通道阻断剂处理可缓解上述异常，并且有效缓解长时程β-肾上腺素刺激导致的HCM-iPSC-CMs钙超载和细胞死亡，有效提高HCM-iPSC-CMs的存活率。
图7：采用患者来源的iPSC-CM模型揭示肥厚型心肌病舒张功能障碍的细胞机制示意图。
该研究建立了一个新颖的平台来研究基于HCM患者的iPSC-CM的舒张功能障碍的相关细胞学机制：shouci在单细胞水平上证明了舒张期Ca2+超载和肌丝Ca2+敏感性增加均与HCM iPSC-CM的舒张功能障碍密切相关。此外，该研究还表明通过常用药物治疗（例如Ca2+通道阻断剂和Na+通道阻滞剂）可以改善HCM-iPSC-CMs的舒张功能。该研究表明，基于HCM患者的 iPSC-CM 模型的功能成像分析和药物检测为心肌细胞病理生理学机制研究和发展潜在的HCM治疗策略提供了新的研究平台。
参考文献:
Haodi, W. , Huaxiao, Y. , June-Wha, R. , Zhang, J. Z. , Keung, L. C. , & Karim, S. , et al. (0). Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal(45), 45.
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