技术文章

血液分子生物学检验技术主要包括PCR技术、DNA测序技术、限制性片段长度多态性（RFLP）、转基因技术及基因芯片（DNA-chip）技术等分子生物学技术。目前这些技术已应用于血液病基因分析、基因诊断、白血病分型、指导治疗、判断预后和微小残留病检测等方面。

（1）核酸分子杂交技术原理和方法

1）Southern印迹杂交

2）Northern印迹杂交

3）核酸原位杂交

（2）聚合酶链反应原理和常用PCR产物检查方法

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术于1985年由美国Mullis等建立。PCR技术使体外扩增核酸片段成为可能，使人们能够在几小时内从试管中获得大量特异核酸片段。由于核酸是生物体储存和传递遗传信息的载体，因此能够迅速获得大量特异核酸片段的PCR技术给生命科学各个领域的研究手段带来了革命性的变化。该技术已经与DNA克隆、DNA重组和DNA测序等技术一样成为血液分子生物学一项*的工具。
1）PCR产物检测

①琼脂糖凝胶电泳

②Southern印迹杂交

③斑点杂交法

④PCR-ELISA法

⑤原位杂交法

（3）以PCR为基础的相关技术

近年来PCR技术在应用的过程中得到了进一步的发展。目前已出现多种以PCR为基础的PCR相关技术，形成了适用于不同目的的PCR技术系列，以下是几种在血液学及检验领域应用较多的PCR相关技术。

1）逆转录PCR

逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是以细胞内总RNA或mRNA为材料进行的体外扩增技术。由于耐热的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作为模板，因此必须先将总RNA或mRNA作逆转录，生成与之互补的cDNA，然后再以cDNA作为模板进行PCR扩增，得到所需要的目的基因片段。RT-PCR常用于克隆cDNA、合成cDNA探针以及分析基因表达等。

2）定量PCR

zui初的PCR技术只是用于定性检测DNA或RNA，对PCR产物的数量并不重视。随着科学研究的逐步深入，人们开始考虑用PCR技术来进行DNA或RNA的定量检测，随之出现了定量PCR（quantitative PCR，Q-PCR）技术这一新名词。目前常用的Q-PCR技术可分为终点法和实时法。

3）多重PCR

多重PCR（multiplex PCR）即在同一反应体系中加入多对引物，以同时扩增一份DNA样品中多个不同序列的靶片段。多对引物间的组合必须满足二个条件，一是将反应条件较为接近的引物组合在一起，以使该反应条件能尽量适合所有被扩增片段，二是同一反应内各扩增片段的大小应不同，以便检测时能通过电泳将各片段分离开。多重PCR比较适用于被检测基因较大，突变点较多的基因。

4）差异显示PCR
差异显示PCR（differential display PCR，DD-PCR）是一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。基因在不同组织细胞中的表达不同，在细胞的不同发育阶段和状态中的表达也有差异。研究基因表达谱的变化有助于理解细胞分化、增殖、细胞周期的调节和细胞衰老、凋亡的过程。

5）原位PCR

原位PCR（in situ PCR）是指组织固定处理细胞内的DNA或RNA，并以其作为靶序列进行PCR反应的过程。原位PCR与普通PCR的主要区别在于模板的制备。经脱蜡处理的组织切片或细胞悬液均可作为扩增样品，所有反应在载玻片上进行。原位PCR技术不仅不需要从组织细胞中分离模板DNA或RNA，而且能在细胞原位进行PCR扩增，大大地提高了检测的灵敏度。目前，原位PCR已成为研究靶基因序列的细胞定位、组织分布和基因表达检测的重要手段。

（4）基因芯片技术

基因芯片技术又称DNA微阵列（DNA - chip）。该技术是二十一世纪生命科学领域广泛应用的一项快速的分子生物学技术。DNA-chip是将大量以特定排列方式的基因探针或基因片段固定于硅片、玻片和塑料片上，样品DNA或RNA通过PCR扩增，体外转录等技术掺入荧光标记分子，与微阵列杂交后再通过荧光扫描仪及计算机分析，即可获得样品大量基因序列及表达信息。目前，基因芯片技术主要应用于白血病的免疫分型、细胞的基因表达检测、基因异常检测及单核苷酸多态分析等。

（5）分子生物学检查在血液学中的应用

1）恶性血液病融合基因的检测

白血病染色体相互易位是导致染色体重排的zui常见原因。染色体重排在分子水平上常形成融合基因。重组产生的融合基因及其融合蛋白是疾病的特异性分子标志。融合基因检测对疾病的诊断、分型、治疗方案的选择、预后判断及微小残留病的检测都有重要的意义。
慢性粒细胞白血病（CML）Ph 染色体易位的后果是使位于9q34上的ABL原癌基因易位至22q11的BCR基因上，形成BCR-ABL融合基因，表达一个具有高*激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，后者是CML发病的分子基础。
急性早幼粒细胞白血病（APL）特异性染色体易位是t（15；17）（q22；q21），易位的结果使15号染色体的PML原癌基因与17号染色体上的维甲酸受体a（RARa）基因融合产生PML-RARa融合基因。临床上变异型APL（M3v，M3b）与急性粒细胞白血病部分分化型（M2）较难鉴别，M2的t（8；21）可产生一种融合基因AML1-ETO，这种融合基因在M2中的发生率为20％-40％，在M2b中可达90％，通过融合基因的检测可准确鉴别这两种白血病。融合基因的检测对治疗方案的选择有明确的指导作用，在ATRA和*达*缓解（CR）的M3，PML-RARa融合基因阳性者极易在十个月内复发，而融合基因阴性者，复发率低。

2）免疫球蛋白重链（IgH）基因和T细胞受体（TCR）基因重排的检测　IgH和TCR的编码基因具有多态性。IgH基因重排是产生个体多样性和*性的主要原因。由于白血病细胞源于造血干细胞，所以白血病细胞是单克隆性的。用PCR方法对重排基因进行扩增，正常白细胞的扩增产物大小不等，呈模糊的阶梯状，而白血病细胞扩增产物经电泳后条带是单一的。约80%的B淋巴细胞白血病可检测到IgH基因重排。通过PCR方法检测IgH和TCR基因重排，有助于急性淋巴细胞白血病的分型以及微量残留的检测。

3）遗传性血液病的诊断　血红蛋白病是常见的遗传性溶血性疾病，血友病是常见的遗传性出血性疾病。基因缺陷包括基因缺失、点突变、插入、倒位等。对于基因重排，可通过RT-PCR进行检测；对于点突变则可用PCR结合酶切位点分析，即当点突变使某一酶切位点消失或在某一区域出现新的酶切位点时，可用该酶切点两侧的引物进行扩增，然后将扩增产物用适当的内切酶切割，根据电泳图谱来判断有无内切酶切点的改变。对于与限制性内切酶点无连锁的点突变，则可采用PCR结合特异寡核苷酸探针（ASO）斑点杂交法进行诊断。

4）HLA基因多态性检测　采用PCR扩增产物的反相杂交（斑点杂交）进行HLA基因多态性检测十分简便、有效。将每个位点的所有寡核苷酸探针固定在固相支持物上，引物先经*化后，进行待测DNA的基因扩增，从而得到*化的DNA放大产物。用此产物与膜上的探针杂交，然后进行显色或化学发光。这样每个样本只需杂交一次即可完成。此方法适合骨髓移植的HLA基因配型及HLA基因与疾病相关性分析等。

5）肿瘤细胞多药耐药基因的检测　多药耐药性（multidrug 　resistance,　MDR）是指肿瘤细胞接触了一种药物以后，不但对该药产生耐药性，而且对其他结构的作用机制不同的药物也产生耐药性。研究发现，MDR的出现常与多药耐药基因（MDR1）过度表达有关，目前已建立Northern印迹法、斑点和狭缝印迹法、RT-PCR法及原位杂交法，从mRNA水平对患者进行测定，了解肿瘤细胞的耐药特性。有研究表明，急性髓细胞白血病MDR1的表达与预后有密切相关，即MDR1阳性者CR率低，生存期短，且易早期复发。

6）基因治疗　基因治疗的目的是应用DNA重组技术和基因转移技术，把野生型的基因导入患者体细胞内，成为正常的基因产物，来补偿缺陷基因的功能，从而使疾病得到纠正。目前认为基因治疗的靶细胞是造血干细胞或间质干细胞等。常用的载体是逆转录病毒和腺病毒。采用含人因子Ⅸ基因逆转录病毒载体转染血友病B患者的原代皮肤成纤维细胞，使其表达一定浓度的因子Ⅸ，这将为血友病B治疗提供新的方法。