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传统荧光显微镜使用荧光物质标志细胞中的特定结构，不仅图像与背景的对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辨率。但当所观察的荧光标本稍厚时，传统荧光显微镜一个难以克服的缺点就显现出来：焦平面以外的荧光使得图片模糊、发虚，对比度降低。

图1. 共聚焦光路

 
       激光共聚焦显微镜恰恰是为解决这个问题应运而生，科学家在光路中放置一个Pinhole，利用这个Pinhole阻挡焦平面以外的荧光（如图1），提高对比度！由于对比度的大大提升，使得通过共聚焦显微镜得到的图像细节更加清晰，因此受到了各个领域研究者的广泛青睐！
共聚焦利用Pinhole排除非焦平面光线干扰，提高图像对比度的同时，我们往往忽略了一个问题，那就是：Pinhole实际上是削弱了荧光信号的（如图2）！只不过共聚焦显微镜利用高功率的激光提供了更强能量的激发光以弥补Pinhole对荧光信号的削弱。

图2. Pinhole对荧光信号的削弱作用

 
       对于固定细胞，高能量激发光的影响主要在对于荧光分子的光漂白作用。而对于活细胞不单单是光漂白作用会影响成像，更加严重的是高能激发光对于活细胞产生的光毒性可能干扰细胞的生理过程。
        zui后一点：共聚焦采用点成像的工作模式，成像速度慢，对于各种动态生理活动的观察时间分辨率低。