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【中文题目】一个小核仁RNA(SNORA13)在核糖体生成和衰老中的非经典作用研究

【文章题目】A non-canonical role for a small nucleolar RNA in ribosome biogenesis and senescence

【发表期刊】Cell（影响因子45.5）

【发表时间】2024年8月22日

【研究团队】美国德克萨斯大学Joshua T. Mendell团队

【研究概要】

细胞衰老是一种由各种应激引起的不可逆的细胞周期停滞状态，包括异常的癌基因激活、端粒缩短和DNA损伤。通过全基因组筛选，研究者发现了保守的小核仁RNA (snoRNA) SNORA13，它在人类细胞和小鼠的多种衰老形式中是必需的。尽管SNORA13指导核糖体解码中心保守核苷酸的假尿苷化，但失去这种snoRNA对翻译的影响很小。然而，SNORA13能够负调控核糖体生成。诱导衰老的应激会扰乱核糖体生成，导致游离核糖体蛋白的积累，从而激活衰老细胞中的p53。因此，SNORA13通过非典型的分子机制调节核糖体生成和p53通路，这种机制与其指导RNA修饰的作用不同。这些发现扩展了我们对snoRNA功能及其在细胞信号传导中作用的理解。

【主要实验】

CRISPRi筛选、RNA荧光原位杂交(FISH)、嘌呤霉素掺入实验、核糖体分析(Ribo-seq、Polysome profiling)、RNA-seq、ChIP实验、质谱分析、UV-RIP实验、突变体构建、小鼠体内实验

【研究背景】

在非转化细胞中，由异常的癌基因激活导致的不可逆的细胞周期停滞状态，称为癌基因诱导的衰老 (OIS)。虽然已经确定了大量参与衰老程序的编码基因，但非编码RNA在细胞衰老中的作用仍然知之甚少。一类与衰老相关的非编码RNA—小核仁RNA (snoRNA)，传统上snoRNA通常可以引导其他RNA化学修饰。大多数snoRNA在编码或非编码转录本的内含子中编码，在剪接过程中切除宿主内含子后，被加工成60-300个核苷酸的成熟形式。除了可以引导RNA修饰，snoRNA还执行各种其他功能，包括调节前mRNA剪接和通过类似miRNA的机制调节靶mRNA。

【研究结果】

首先，该研究通过CRISPRi技术筛选到了一个OIS相关的非编码RNA—EPB41L4A-AS1，它是一个高度保守的H/ACA盒snoRNA SNORA13的宿主转录本。进一步研究发现，敲低EPB41L4A-AS1阻止了HRAS^G12V诱导的细胞衰老，使细胞持续增殖，表明EPB41L4A-AS1和其编码的SNORA13在OIS中至关重要。随后，利用CRISPR技术对SNORA13进行敲除，但保证剪接后的EPB41L4A-AS1转录本正常表达。进一步通过致癌基因诱导实验、回补实验、DNA损伤处理实验，证明了SNORA13是多种形式衰老所必需的，而非剪接后的EPB41L4A-AS1转录本。

图1. 鉴定了一个OIS相关的非编码RNA—EPB41L4A-AS1，其编码SNORA13

接下来，深入研究了SNORA13参与衰老的分子机制。细胞分离和FISH实验证明，SNORA13定位于核仁，且致癌基因诱导后不影响该snoRNA的定位及整体表达。通过多种分析证实了SNORA13是18S.1248U假尿苷化所必需的。由于18S:1248U位点上m¹acp³Ѱ修饰在真核生物中是保守的，这种核苷酸修饰定位于核糖体解码中心，于是推测SNORA13缺失可能会影响编码衰老调节因子mRNA的翻译。随后，通过嘌呤霉素掺入实验发现，在正常生长情况下SNORA13缺失后整体翻译没有明显变化。不过，在致癌基因诱导下缺失SNORA13的细胞中翻译水平有所增加，但这可能是由于这些细胞相对于野生型细胞持续增殖的次要后果，因为p53的缺失也会导致这些条件下翻译的增加。

对野生型和敲除SNORA13的BJ-HRAS^G12V细胞进行Ribo-seq和RNA-seq分析，发现在SNORA13敲除的细胞中，只有少数转录本显示出翻译效率（TE）的显著改变。密码子分析发现，富含A/U的转录本TE增加，富含G/C的转录本TE反而降低，这与之前的研究结果相似。在正常生长情况下，SNORA13缺失对密码子使用特异性影响极小。以上结果表明，SNORA13不太可能通过改变整体翻译效率、转录本或密码子特异性来调节衰老。此外，研究者注意到与之结果不同的另一项研究，即敲除TSR3后的翻译及随后18S rRNA中该位点acp3修饰的缺失，这影响了核糖体蛋白（RP）编码mRNA的翻译。这种差异可能是由于随后添加acp3并不需要该核苷酸的假尿苷化。

图2. Polysome profiling绘制核糖体图谱

采用Polysome profiling分析敲除SNORA13的BJ-HRAS^G12V细胞中核糖体亚基和翻译核糖体丰度。结果发现，在SNORA13敲除细胞中，无论致癌基因HRAS^G12V激活与否，游离60S亚基和单核糖体80S的稳态丰度均显著增加。随后，利用一个表达内源性SNAP标签的大核糖体亚基蛋白RPL28的HEK293T细胞系，监测60S核糖体亚基生成。SNORA13基因缺失会导致总的及新形成的60S核糖体亚基和80S单核糖体丰度增加。使用EDTA将多核糖体解聚成游离的核糖体亚基，也证实了SNORA13的缺失会增加60S亚基的稳态丰度。此外，与野生型相比，在敲除SNORA13的细胞中新标记的RPL28会更快从核仁中消失，即更快组装成60S并进入细胞质中。总之，SNORA13参与了细胞在生理条件下对核糖体生成的调控，并在营养缺乏时抑制核糖体的生成。因此，SNORA13是核糖体生成的一个强负调控因子。

图3. SNORA13通过核仁应激反应途径调节p53的活性

通过基因集富集分析（GSEA）分析发现，在SNORA13敲除细胞中p53通路活性下降。在致癌基因诱导后，大量的p53蛋白定位于细胞质，且p53与靶基因CDKN1A启动子区域的结合显著减少。SNORA13敲除还会导致MDM2蛋白活性增强，从而抑制p53的核积累和转录激活活性。而癌基因诱导的核仁应激反应，可以通过游离的RP与MDM2结合来抑制MDM2活性。敲除SNORA13后，由于60S亚基生成加速，游离RP减少，导致MDM2对p53的抑制作用增强，最终阻碍了细胞衰老。这些结果表明，SNORA13通过核仁应激反应途径调节p53的活性。

之后，研究者构建了SNORA13的突变体，发现SNORA13突变后丧失了引导假尿苷化修饰，但仍能与RPL23结合，而且突变体可以恢复SNORA13敲除导致的细胞衰老表型。此外，与敲除SNORA13基因相反，敲除EMG1和TSR3（分别催化18S:1248U的N1甲基化和acp的添加）后，当HRAS^G12V表达激活下进入细胞衰老。以上结果说明，SNORA13通过一种不同于引导假核苷化的非典型机制来调节核糖体的生成和衰老。

图4. SNORA13直接与核糖体蛋白RPL23相互作用，抑制RPL23：28S rRNA相互作用

利用反义寡核苷酸（ASOs）从紫外交联的细胞中分离内源性SNORA13核糖核蛋白复合物（RNP）做质谱分析，鉴定到几种显著富集的互作蛋白，其中包括大核糖体亚基组分RPL23。UV-RIP实验进一步证实了SNORA13与RPL23的特异性结合。同样地，使用ASOs从紫外交联细胞中下拉出内源性SNORA13，证明了RPL23的特异性共纯化。这些结果表明，SNORA13直接与RPL23相互作用，并且这种相互作用发生在核糖体亚基组装完成前。体外实验进一步证实，重组RPL23可以与SNORA13形成复合物，但不能与SNORA25形成复合物。因此，SNORA13直接与RPL23相互作用，抑制RPL23：28S rRNA相互作用。基于以上结果，研究者提出SNORA13通过抑制RPL23整合到正在成熟的60S亚基中来负向调控核糖体生成，从而增强致癌基因诱导的核仁应激反应。

最后，在小鼠中鉴定到了三个SNORA13的同源基因，且仅在同时敲除三个同源基因后才会导致60S亚基增加，这与人类细胞中的表型一致。这表明小鼠SNORA13同源基因功能冗余，共同调控60S亚基生成。之后，利用OIS小鼠模型，进一步证明了SNORA13对体内OIS过程至关重要，且其在调控衰老的作用在人类和小鼠中保守。

【Polysome Profiling技术介绍】

基因表达在多个层面上受到调控，包括：表观遗传水平调控、转录水平调控、翻译水平调控以及翻译后修饰调控。其中，翻译调控控制着蛋白质的生物合成以响应生理和病理的变化。而且，翻译水平的调控也深刻影响了蛋白质的丰度。

研究翻译水平的调控机制，有助于深入理解基因表达调控机制，并且可以解释转录组和蛋白质组分析之间的差异。多聚核糖体分析（Polysome profiling）是研究翻译调控机制常用的技术。Polysome profiling基于蔗糖梯度分离出free mRNA、40S核糖体亚基、60S核糖体亚基、80S monosome以及Polysome等组分。

Polysome profiling可用于特定mRNA的目标分析以及翻译整体分析。此外，也可以获取正在翻译的全长mRNA，包括非翻译区（UTR）。UTR含有选择性翻译的顺式作用元件。鉴定UTR中调控翻译的顺式作用元件，对于解析基因表达调控的机制至关重要。此外，Polysome profiling可以与免疫印迹或蛋白质组学联合使用，用于鉴定与核糖体结合或者与翻译起始相关的蛋白质。最后，Polysome profiling特别适合于尚未进行全基因测序或者遗传转化操作困难的物种。

【参考文献】

Chassé H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Res. 2017, 45(3):e15. doi: 10.1093/nar/gkw907.

Cheng Y, Wang S, Zhang H, Lee JS, Ni C, Guo J, Chen E, Wang S, Acharya A, Chang TC, Buszczak M, Zhu H, Mendell JT. A non-canonical role for a small nucleolar RNA in ribosome biogenesis and senescence. Cell. 2024, 187(17):4770-4789.e23. doi: 10.1016/j.cell.2024.06.019.