技术文章

RNA Pull Down和RIP的技术应用：ELF18诱导的lncRNA ELENA1与MED19a互作增强拟南芥免疫反应

植物和动物在自然环境中都面临着被各种微生物感染的风险。与动物一样，植物也演化出了一套模式识别受体（PRRs），这些受体能识别整个微生物病原体类别的分子特征，进而启动先天免疫反应。本文鉴定了拟南芥中一种长非编码RNA（lncRNA）-ELENA1，通过In Vitro RNA Pull-Down、RIP等技术揭示了ELENA1调控拟南芥抗病性的机制。

1、ELENA1通过受体依赖途径表达

为探究lncRNA在植物免疫中的调节途径，作者通过T-DNA插入得到敲除突变体efr-2和fls2，使用elf18及flg22处理后，通过RT-PCR分析发现，与野生型对比受体敲除株efr-2和fls2中的ELENA1被抑制转录。此外ELENA1启动子-GUS分析证实其启动子携带对elf18和flg22高度响应的顺式作用元件。以上结果表明ELENA1转录是通过受模式识别受体（PRR）依赖途径调节的。

图1.ELENA1的转录水平由elf18和flg22诱导

2、ELENA1作为lncRNA正调控植物抗病性

为了研究ELENA1是作为非编码RNA还是编码RNA在植物先天免疫中发挥功能，作者首先构建了两种不同的突变植物35S:5m_ELENA1（ELENA1_5M）和35S:8m_ELENA1（ELENA1_8M）。分析了四种不同ELENA1表达水平（1800-3200倍）的过表达株系，发现过表达植株中ELENA1的转录水平已经高于PR1表达的饱和水平，ELENA1的表达水平不会显著影响PR1的表达水平。同时使用elf18对ELENA1过表达的转基因植物进行处理，与野生型相比PR1 表达水平与ELENA1相似均有所增加。

随后作者通过人工miRNA构建了ELENA1过表达株和敲除株。使用Pst DC3000处理，通过表型观察，RT-qPCR等实验发现，与野生型相比，ELENA1敲除株对Pst DC3000的耐受性更低，而ELENA1过表达株的耐受性更高。同时PR1和PR2的表达情况与ELENA1呈现出相同的趋势。以上结果表明ELENA1作为lncRNA正调控PR相关基因的表达来抵抗细菌病原体。

图2. ELENA1敲除与过表达株系的防御表型

3.ELENA1正调控elf18诱导的免疫反应的基因

为了探究ELENA1在调节免疫反应中的作用及其调节的基因，使用elf18分别处理野生型和ELENA1过表达株系0 h、1 h、6 h、12 h后，通过聚类分析、基因本体富集分析，发现具有系统获得性抗性、免疫反应和防御反应相关的基因显著富集，表明ELENA1正向调节elf18诱导的防御基因。同时鉴定出了145个在野生型和过表达ELENA1植株中表达水平增加的防御基因，最终通过筛选将PR1、PR2、CRK7、BG3和CYP82C2定为靶标基因，通过RT-PCR实验验证以上基因在ELENA1过表达株和敲除株中的表达情况，结果显示以上靶标基因在ELENA1过表达和敲除株中的表达水平显示出明显的负相关。这些结果证实了ELENA1正向调节对elf18有反应的选择性防御相关基因的表达。

图3. ELENA调控elf18诱导的免疫反应基因

4.ELENA1与MED19a在体内和体外均存在相互作用

为检验拟南芥中ELENA1与介体亚基之间可能的直接相互作用，作者使用BindN软件筛选了一组可能具有RNA结合位点的中介体亚基。随后利用RNA Pull-Down技术鉴定与ELENA1结合的中介体亚基，结果显示MED19a与MED26b均能在体外与ELENA1 RNA结合，同时利用elf18处理MED19a/MED26b敲除株，发现只有MED19a敲除株中PR1表达情况显示出与ELENA1敲除株系相似的趋势。进一步利用GFP标记法、TriFC、RIP实验证明中介体亚基MED19a与ELENA1在体内也存在相互作用。以上结果说明MED19a是PR1表达的主要调节因子，与ELENA1在体内和体外均存在相互作用，并且这种相互作用在elf18处理后得到增强。

图4. ELENA1与MED19a相互作用

5.ELENA1和MED19a相互作用调控PR1表达

为了研究ELENA1、MED19a、PR1表达间的关系，作者构建了四种不同的ELENA1和MED19a的双转基因株系分别为35S:ELENA1/med19a-1(E1/m19a)、ELENA1KD-10/UBQ:MED19a(e1#10/M19a)、ELENA1KD-10/med19a-1 (e1#10/m19a)和35S:ELENA1-16/UBQ:MED19a (E1#16/M19a)。使用elf18进行处理，通过RT-qPCR实验对不同株系的相关基因表达情况进行分析。结果显示，E1/m19a株系与ELENA1过表达植物 (E1#16) 相比PR1表达显著下降，但略高于med19a-1突变体(m19a)。在ELENA1 KD突变体背景中，MED19a的过表达(e1#10/M19a)对PR1表达没有显著影响，与e1#10/M19a相比E1#16/M19a株系PR1表达更高，说明ELENA1和MED19a相互作用进一步增强PR1表达。以上结果说明在elf18处理下，MED19a对PR1表达的促进作用依赖于ELENA1，但在MED19a之外，还有其他因素与ELENA1相关联以促进PR1表达。

图5. PR1在ELENA1和MED19a双突变体中表达情况

6.ELENA1促进MED19a富集于PR1启动子

为了研究ELENA1和MED19a是直接还是间接调控PR1基因表达，作者构建了转基因株系PMED19a:GFP-MED19a，通过染色质免疫沉淀（ChIP）、qPCR定量实验显示MED19a富集在含有AS-1类似元素的PR1启动子P4区域。使用elf18进行处理，发现MED19a在PR1启动子上的富集在处理后6小时达到最高，在12小时减少。同时观察了突变体中MED19的富集情况，与野生型相比，在ELENA1敲除株系中MED19a在PR1启动子P4区域的富集大幅减少，而ELENA1过表达株系中MED19a的富集增加。以上结果说明ELENA1促进了MED19a在PR1启动子上的富集。

图6. ELENA1促进PR1启动子上MED19a的富集

小结：植物的免疫反应是一个涉及基因表达和转录后调控的复杂的过程。本文鉴定了拟南芥中一种长非编码RNA（lncRNA）-ELENA1。ELENA1能够增强拟南芥对细菌病原体的抵抗力，其机制是通过与中介体亚基MED19a相互作用，并影响MED19a在抗病相关基因PR1启动子上的富集，从而调控PR1的表达。这一发现揭示了lncRNA在植物先天免疫中的重要作用，为理解植物免疫反应的复杂性提供了新的视角。

蓝景科信技术简介

RNA Pull Down

RNA Pull Down是根据已知的RNA序列，设计DNA模版，然后使用体外转录技术合成带标记的RNA探针，并与蛋白提取液进行孵育，形成RNA-蛋白质复合体。使用链霉亲和素磁珠纯化富集RNA-蛋白质复合体，将富集到的蛋白质进行LC-MS/MS检测，最终鉴定出与RNA互作的蛋白质。

RNA 免疫共沉淀测序（RIP-Seq）

RNA免疫共沉淀测序（RNA Immunoprecipitation Sequencing, RIP-seq）是研究细胞内RNA与蛋白质结合的技术。原理是利用目标蛋白的特异性抗体，将对应的蛋白-RNA复合体进行免疫沉淀，对分离纯化的RNA进行建库与高通量测序。