细胞污染一般可分为微生物污染和真核生物污染。其中微生物污染包括真菌和酵母、细菌、支原体等。而真核生物一般是细胞系间的交叉污染。 细胞常见的污染情况总结如下:
1、细菌污染
细菌是一种原核细胞微生物,其大小以微米(μm)计。常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等,革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。
一旦发生细菌污染较易发现,多数情况下培养液短期内颜色变黄,表明有大量酸性物质产生,出现明显混浊现象;有时静置的培养液液体初看不混浊,但稍加振荡,就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察,可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类;有的培养液改变不明显而又疑有污染,可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种,也可取10ml细胞悬液以100rpm离心5min,沉淀中加入无抗生素的培养液2ml,置于37℃培养,24h可得结果。污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡,造成试验失败和细胞株(系)丢失。
看到这种,别犹豫了你的细胞被污染了,那么怎么办呢,基本原则立马扔掉,别扩大污染,如果你的细胞真的十分宝贵,先用带有双抗的PBS反复冲洗几遍,然后再培养液中加入硫酸庆大霉su、新霉su(50ug/ml)等,培养3天后换成带有双抗的培养液培养。
2、真菌污染
是细胞培养过程中最常见的一种,尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见,较易被发现,短期内培养液多不混浊,倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝,并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠;念珠菌或酵母菌形态呈卵形,散在细胞周边和细胞之间生长。镜下看时,要将培养瓶用酒精棉球擦干净,以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
真菌污染真的不建议处理,因为孢子容易飘散,可能这瓶没9过来,又扩大了污染,建议预防为主,在培养箱的水中加入硫酸铜,就是蓝色的那种东西。哎,如果你非救不可,可以采用两性霉su B(0.25-2.5),三天后换液加入含PS的培养液。
3、支原体污染
支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2um)并独立生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性。可为圆形、丝状或梨形。
支原体形态多变,在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构。其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似,但微绒毛电子密度比支原体小,且中央无颗粒群或中央束。
支原体污染细胞后,培养液可不发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著,细微变化也可由于传代、换液而缓解,因此易被忽视。但个别严重者,可致细胞增殖缓慢,甚至从培养器皿脱落。
如果怀疑细胞被支原体污染可使用支原体检测试剂盒进行检测,如果确定是支原体污染可以选择支原体去除试剂进行处理。
4、霉菌污染
同真菌感染一致,因为培养液是清亮的,所以霉菌污染早期难以发现,等发现时往往已经为时过晚了。培养液中慢慢地出现絮状杂质,镜下可见呈细丝状的团状漂浮物,如同风中柳絮,一般不仔细看发觉不出来。细胞仍可生长,但时间一长,细胞的状态就变差,不再增长。
处理方法:建议果断舍弃该污染细胞,将环境*消毒,因为霉菌的顽固可能会导致下几批细胞都会污染,所以,采用酒精*底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新洁尔灭擦洗一遍,把水盘里加上饱和量的硫酸铜。千万不可大意!
5、黑胶虫污染
开始污染时对细胞无影响,当数量达到一定程度时就会对细胞产生影响。400倍显微镜下可见点状或片状游动小体,培养液也是不浑的,一般不会太影响,细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好,且观测到的运动物无明显增多,且培养液颜色、透明度无明显变化,对细胞生长状态不会有明显影响,在细胞增殖旺盛之后会自然消失,除更换血清外无须特殊处理。
处理方法:可以增加细胞的种板密度,以提高细胞的生存率,尽早处理细胞,越快越好。如果实在来不及了,推荐使用——黑胶虫清除培养基