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正是因为固相多肽合成如此“好用"，自1920年多肽药物胰岛素问世以来，多肽药物就重塑了在现代制药领域的地位。在过去的20多年里，将近有近超过60种多肽类药物获得批准。根据一项多肽行业的数据分析，2016年至2024年多肽治疗的年增长率将达到9.1%。多肽行业的发展，除了固相多肽合成技术的进步之外，现实的需求也很强劲，比如代谢疾病和癌症发病率持续增加，需要更多多肽药物来进行治疗。当然，需求大，自然来钱多，治疗代谢性疾病的多肽类药物，例如(Victoza)和类胰高血糖素肽1(GLP-1)每年至少有20亿美元的销售额[1]。

咱们今天就来聊聊多肽药物制备的那些事儿。

多肽药物制备二三事

多肽泛指2～100个氨基酸经肽键连接形成的化合物，多肽药物具有生物活性高，特异性强，副作用小等特点。

从合成角度看，多肽药物的制备主要有化学合成、基因重组及天然提取三种方法，其中固相化学合成多肽技术拥有产率佳，纯度高，质量稳定，环境友好等优势，被广泛应用于3～50个序列的多肽原料药生产。

也正是因为固相多肽合成如此“好用"，自1920年多肽药物胰岛素问世以来，多肽药物就重塑了在现代制药领域的地位。在过去的20多年里，将近有近超过60种多肽类药物获得批准。根据一项多肽行业的数据分析，2016年至2024年多肽治疗的年增长率将达到9.1%。多肽行业的发展，除了固相多肽合成技术的进步之外，现实的需求也很强劲，比如代谢疾病和癌症发病率持续增加，需要更多多肽药物来进行治疗。当然，需求大，自然来钱多，治疗代谢性疾病的多肽类药物，例如(Victoza)和类胰高血糖素肽1(GLP-1)每年至少有20亿美元的销售额[1]。

咱们今天就来聊聊多肽药物制备的那些事儿。

多肽药物制备二三事

多肽泛指2～100个氨基酸经肽键连接形成的化合物，多肽药物具有生物活性高，特异性强，副作用小等特点。

从合成角度看，多肽药物的制备主要有化学合成、基因重组及天然提取三种方法，其中固相化学合成多肽技术拥有产率佳，纯度高，质量稳定，环境友好等优势，被广泛应用于3～50个序列的多肽原料药生产。

那么厉害的固相多肽合成，了解一下

(1) 有保护基氨基酸的脱保护反应；

(3) 偶联反应-形成酰胺键并合成最终的多肽。

 

这类杂质源于在氨基酸上接入Fmoc基团的试剂和已经成形的Fmoc-氨基酸发生副反应。二肽杂质存在会导致目标氨基酸重复插接。

图2 二肽杂质

β-丙氨酰类杂质

游离氨基酸源于氨基酸与Fmoc试剂的不反应。游离氨基酸存在会导致多个目标氨基酸重复插接肽链，导致Fmoc基团在Fmoc-氨基酸衍生物储存过程中自动催化裂解。

毫无疑问，这些杂质都会大大降低固相多肽合成的产率和纯度，增大提纯难度。

多肽合成中的“隐藏杀手"：乙酸

相比于氨基酸骨架的杂质，乙酸则更像是固相多肽合成的“天敌"。由于分子量小且也会被活化剂活化，具有高反应活性，即便痕量乙酸也会在固相合成过程中截断延伸的肽链。

有很多人觉得一点点乙酸，无关紧要。那咱们来做个数学题：

Fmoc-Arg(Pbf)-OH受到低至0.1%的乙酸污染，就相当于1mol%的乙酸污染。但如果考虑到通常试剂用量会超出5倍，而高反应活性乙酸会先于氨基酸与肽段结合，则每次循环会造成高达5%的链终止。如果合成的多肽含有3%的残基，则意味着15%的链会终止。

图4 乙酸对合成多肽的影响

下图是实例展示。仅仅0.1%的乙酸污染对于21 mer多肽合成的影响；截断的副产物采用“*"表示。

图5 含有乙酸合成多肽的HPLC谱图

Fmoc-氨基酸中的乙酸很难检测，默克专门开发了标准Fmoc-氨基酸中乙酸定量的方法。

跟所有工业产品一样，氨基酸原料的纯度也存在批次差异。这里有个规律，纯度越高，差异性就越小。

多肽批次间差异

谈完原料，可以说说多肽了。

序列相同的多肽，不同批次间存在差异，这个无法避免。序列不同的多肽，本身的性质也有差异，比如聚集 – 疏水性多肽的浓度越高，聚集也越高，活性主要取决于聚集形态下的活性。

此外，稳定性也很重要。多肽在储存过程中会有化学转变。比如含有Asp-Gly的多肽导致形成iso-Asp，多肽中的Cys通过形成二硫键而交联以及Met氧化成亚砜和焦形成。这些杂质有可能带有细胞毒性，比如二硫苏糖醇（DTT）。

除了纯度之外，多肽的稳定性跟储存有关，冻干状态常比溶液更稳定；再一个影响稳定性的因素就是氨基酸组成和序列，所谓sequence depends！

下面是几个典型的组成和序列导致的稳定性降低。

氧化：Cys (C)和Met (M)残基是发生可逆氧化的主要氨基酸。残基发生氧化后形成亚砜和/或砜，很难逆转。

二酮和焦形成：二酮形成通常发生在(G)位于N末端第3位点时，Pro (P)或Gly (G)位于第1或第2位点时更易发生。如果Gln (Q)位于序列的N末端位点，则焦形成几乎是不可避免的。这种转变也可能发生在N末端位点含有Asn (N)的多肽序列中，但可能性较小。

归根到底，想要高质量的多肽产品，就一定需要高品质的原料和试剂。