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反相色谱柱的注意事项和维护保养

  色谱柱的正确使用方法和细致的维护工作很重要，使用和维护不当会降低柱效、缩短寿命甚至损坏。在反相色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱的高效性和******性。

一、避免压力和温度的急剧变化

温度突变或使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。

二、★勿直接改变溶剂组成

改变溶剂的组成时，应逐渐缓慢改变，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。

三、★禁止反冲

一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

四、流动相方面

★1.流动相须经过超声和0.45um滤膜除去微粒；

★2.纯度要求 

→超纯水（HPLC用水）；

→缓冲液pH值2~8；

→缓冲盐浓度（一般10mM~20mM）；

→有机溶剂（色谱纯，杂质含量尽量低）。

★提示：选择使用适宜的流动相（尤其是pH），可避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，可使流动相在进固定相之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。

五、样品方面

1.确保样品不和填料基质相互作用；

2.了解样品的溶解性，若样品的溶剂不是流动相，用流动相试溶解，防止样品析出；

3.样品上样前须经过0.45um的滤膜过滤去除微粒和杂质；

4.避免将复杂的样品尤其生物样品直接注入柱内，在进样器和色谱柱间连一保护柱。

六、保清洁防干燥

保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。

七、加补填料

反相色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。

八、清洗

★水/乙腈（95/5）→****乙腈→乙腈/异丙醇（75/25）→****异丙醇→****二氯甲烷→****己烷

九、再生

★30倍柱体积 正己烷→二氯甲烷→异丙醇→二氯甲烷→流动相。

★注意：若需用到二氯甲烷、己烷，使用反相流动相前需用异丙醇过渡 。

★柱子使用完后，用洗脱能力强的洗脱液冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。

十、保存  

1.存放前的处理（除去杂质、缓冲盐）； 

2.合适的存放溶剂（甲醇抑菌能力强于乙腈）； 

3.避免柱床的干涸；

4.避免机械震动（轻拿轻放）； 

5.存放的温度4~30℃。 

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