在继续探讨NCI-H460（H460）人大细胞肺癌细胞的实验操作步骤时，我们需深入至细胞培养、处理及实验设计的核心环节。首先，确保实验室环境无菌且适宜细胞生长，包括调整温度至37°C，维持5% CO₂的饱和湿度环境。

     接下来，进行细胞复苏与培养。从液氮罐中迅速取出冻存的H460细胞，于37°C水浴中快速解冻，避免冰晶形成对细胞造成损伤。随后，将细胞悬液转移至含有预热培养基（如RPMI-1640加10%胎牛血清）的离心管中，低速离心去除冻存液，重悬细胞并接种至培养瓶中，置于培养箱中培养。定期观察细胞生长状态，适时更换新鲜培养基，确保细胞处于对数生长期。

     进入实验阶段，根据具体研究目的设计实验方案。例如，若研究药物对H460细胞增殖的影响，需设置不同浓度的药物处理组及对照组。首先，将细胞以适当密度接种至培养板或培养皿中，待细胞贴壁并达到实验所需密度后，加入含不同浓度药物的培养基，继续培养一定时间（如24、48或72小时）。

     随后，利用MTT法、克隆形成实验或流式细胞术等方法检测细胞增殖能力、凋亡情况及细胞周期分布等生物学特性变化。通过数据分析，评估药物对H460细胞的抑制效果及其潜在机制。

     此外，还可结合分子生物学技术，如Western Blot、qPCR等，进一步探究药物作用下的信号通路变化，为肺癌的靶向治疗提供理论依据和实验支持。综上所述，针对NCI-H460细胞的实验操作步骤需严谨细致，结合多种技术手段，以全面揭示其在特定条件下的生物学行为及潜在治疗靶点。