小鼠原代下丘脑神经元细胞培养对无菌、操作轻柔度和培养基要求很高，标准操作流程如下：

一、培养前准备

‌试剂预配预温‌：配制预冷的解剖液（DMEM/F12 + 10mM HEPES + 1%双抗）、0.25%、种植培养基、维持培养基（Neurobasal + 2%B27 + 1%GlutaMAX + 1%双抗），所有使用前放入37℃水浴预温。

‌包被培养板‌：用0.1mg/mL多聚赖氨酸包被培养瓶/培养板，室温包被过夜后，用无菌PBS冲洗3次，超净台内晾干备用，避免神经元贴壁不良。

‌环境消毒‌：超净台紫外线消毒30分钟，手术器械提前高压灭菌，75%酒精消毒台面。

二、脑组织取材（孕14-16天小鼠胚胎，神经元活性最佳）

脱颈处死孕鼠，75%酒精消毒腹部皮肤，剖开腹腔取出子宫，放入预冷的无菌解剖液中。

剪开子宫壁取出胚胎，分离出完整脑组织，转移至新的预冷解剖液中。

体视显微镜下剥离脑膜，准确分离出下丘脑区域，收集组织块到离心管。

三、组织消化与细胞分离

吸去多余解剖液，加入0.25%（每100mg组织加1mL），37℃水浴消化15分钟，每5分钟轻轻晃动一次。

消化结束后，吸出，加入5mL种植培养基终止消化，再用种植培养基清洗2次去除。

用口径渐小的玻璃移液管轻轻吹打组织块，直到形成均匀细胞悬液，静置2分钟让未消化的组织块沉淀。

吸取上层细胞悬液，200目细胞筛过滤，1000rpm室温离心5分钟，弃上清。

用种植培养基重悬细胞沉淀，用血球计数板调整细胞密度到1×10^6个/mL。

四、接种与培养

将细胞悬液接种到提前包被好的培养板/瓶，轻轻晃动使细胞均匀分布，放入37℃、5%CO₂饱和湿度培养箱。

接种24小时后，全量更换为维持培养基，去除未贴壁的死细胞和杂细胞。

之后每3天半量换液：吸出一半旧培养基，加入等量新鲜维持培养基，避免冲击贴壁的神经元。

五、冻存（备用储存）

培养7-10天，神经元成熟状态最佳时，用轻轻消化收集细胞。

用冻存液（90%胎牛血清 + 10%DMSO）重悬细胞，调整密度为1×10^6~2×10^6个/mL，分装到冻存管。

放入异丙醇梯度降温盒，-80℃过夜后转移至液氮长期保存。

关键注意事项

取材全程保持低温，操作尽量在冰上进行，避免神经元缺氧死亡；

吹打组织时动作轻柔，避免过度吹打导致神经元机械损伤，降低存活率；

必须使用无血清的神经元维持培养基，添加B27添加剂，抑制胶质细胞过度增殖。