ELISA试剂盒所谓的单波长比色等于一般的以对显色具有zui大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在灵敏波长如450nm和非灵敏波长630nm下各测定一次，灵敏波上下的吸光度测定值为样本测定酶反响特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、尘埃等脏物所造成的的吸光度之和；非灵敏波长下测定即改动波长至必定值，EELISA试剂盒使得样本测定酶反响特异显色的吸光度值为零，此刻测得的吸光度即为脏物的吸光度值。
ELISA试剂盒以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有运用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时替换。zui终酶标仪给出的数值为灵敏波长下的吸光度值与十分感波长下的吸光度值的差。以软板为载体的实验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。ELISA试剂盒比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔。
由于ELISA试剂盒测定中单个空缺孔的非特异吸收上有必定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空缺孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，所以在ELISA测定比色时，是运用双波长比色。ELISA试剂盒因而，双波长比色测定具有能扫除由微滴板自身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、尘埃等对特异显色测定吸光度的影响的利益。比色成果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按划定用吸光度（absorbence，A），两者意义相同。