在ELISA试剂盒中通常有3次加样步聚，即加标本，加酶物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA试剂盒板孔的底部，防止加在孔壁上部，并留意不行溅起，不行产生气泡。
加标本通常用微量加样器，按规则的量参加板孔中。每次加标本应更换吸嘴，避免发作穿插污染，也可用一次性的定量塑料管加样。
有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规则的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中参加稀释液，再在其间参加血清标本，然后在微型震动器上震动1分钟以确保混和。加酶物使用液和底物使用液时可用定量多道加液器，使加液进程敏捷完结。在ELISA试剂盒中通常有两次抗原抗体反响，即加标本和加酶物后。抗原抗体反响的完结需要有必定的温度和时刻，这一保温进程称为温育（incubation），有人称之为孵育，在ELISA检查试剂盒中似不恰当。
ELISA试剂盒属固相免疫测定，抗原、抗体的只在固相表面上发作。以抗体包被的夹心法为例，参加板孔中的标本，其间的抗原并不是都有平等的和固相抗的机会，只要zui靠近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体触摸。这是一个逐，因此需经分散
才干到达反响的结尾。在其后参加的酶符号抗体与固相抗原的也相同如此。这即是为什么ELISA检查试剂盒反响老是需要必定时刻的温育。
温育常选用的温度有43℃、37℃、室温文4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体的适宜温度。在树立ELISA方法作反响动力学研讨时，实验标明，两次抗原抗体反响通常在37℃经1-2小时，产品的生成可达高峰。为加快反响，可提高反响的温度，有些实验在43℃进行，但不宜选用更高的温度。抗原抗体反响4℃更为*，在放射免疫测定中多使反响在冰箱中，以构成zui多的沉积。但因所需时刻太长，在ELISA试剂盒中通常不予选用。
ELISA试剂盒的质量凹凸因素取决于这两个方面
1.选材目标。
2.选材进程。
胎牛血清用于选材的胎牛应健康无病并且在的出世天数之内，ELISA试剂盒选材进程应严厉依照操作规程履行，制备出的血清要经过严厉的质量判定。格外请求有：
a.要经过滤膜过滤除菌，确保无菌；
b.证实所用血清中不含对所出产疫苗病毒的抑制物；
c.无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家请求无细菌噬菌体污染；
d.对细胞有杰出的支撑繁衍效果；
e.有必要来自有文件证实无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具有适当的监测体系。