疫苗研发中佐剂粒度的分析

近日，天津大学生命科学学院成功研发出*口服疫苗的消息登上热搜，随着*疫情的爆发，相关疫苗的新闻就频频刷屏，公众一直期待着研制出有效的疫苗，助力战胜*肺炎疫情，目前*已经批复支持了5种疫苗的研发，包括灭活疫苗、减毒疫苗、核酸疫苗、载体疫苗和重组蛋白疫苗。这些疫苗的研发都在紧锣密鼓地进行中，作为疫苗中的重要组分，疫苗佐剂能提高机体对抗原的特异性免疫应答，能够在免疫反应低下的人群中诱导全面持久的免疫应答，因此疫苗佐剂在疫苗中具有重要作用。

铝佐剂

铝佐剂是目前应用较为广泛的疫苗佐剂。疫苗用铝佐剂主要有*、*和明矾 等，其中*应用较多。*佐剂以4.5nm×2.2nm×10nm存在的纤维状粒子，IEP为11.4，这种粒子聚集后以松散的1-10μm大小的形式存在。铝佐剂的作用机理主要包括储存库效应、免疫刺激效应，铝佐剂还可以通过活化Nlrp3炎性小体刺激先天免疫和诱导单核细胞分泌IL-1β和IL-18等。不过很多科研学者进行的大量研究存在不同的试验结论，对于铅盐佐剂的作用机制，目前仍没有统一、明确的结论，后续还需要大量的工作来探索这些作用机制。

铝佐剂的颗粒大小及均一程度都会对疫苗的免疫效果造成影响。颗粒大小和吸附能力呈负相关，对传统的氨水配置*佐剂的工艺改良，使佐剂的粒径分布自517-950nm降至275-435nm，且均一性得到改善，发现其吸附能力得到较大提高。

另外不同的冻干工艺对铝佐剂的聚集影响差异很大，而且聚集与它本身的浓度相关，一般随着铝盐浓度的增加而增大。在常规冻干工艺中，如果存在大颗粒铝盐，小颗粒会更容易聚集成更多的大颗粒，这些聚集通过机械外力也很难逆转，添加赋形剂或稳定剂也很难有成效，失去提高疫苗免疫原性的价值。我们通过使用AccuSizer 780系列来进行检测，从而精准测试铝佐剂颗粒大小真实分布以及颗粒浓度参数，弥补传统粒度检测中无法准确检测到大颗粒粒径和含量难题。

纳米化铝佐剂

将铝佐剂制备成纳米颗粒后，由于其粒径更小，比表面积急剧增大，具有表面反应活性高，活性中心多，吸附能力强等特性，在相同铝含量的情况下，可吸附更多的抗原。有相关研究发现纳米铝佐剂制备的疫苗更易被地城细胞摄取，诱导细胞免疫和体液免疫，且炎性反应较弱。但近年来研究也发现，纳米材料在生物安全性和毒性方面存在一定的隐患，小于200nm的颗粒可以通过血脑屏障，纳米金属及其氧化物可对肝肾组织造成损害。我们通过使用Nicomp 380系列，可以获得纳米铝佐剂的粒径分布，同时通过*的Nicomp去卷积多峰分布，可以获得粒径组分的分布，帮助判断是否存在更大或者过小的颗粒存在，从而避免纳米铝佐剂的因粒径大小带来的安全问题。

乳剂型佐剂和脂质体佐剂

乳剂型佐剂也是临床应用较多的商品化佐剂，能有效提升抗体水平并延长抗体维持时间，诱导单核细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞等在注射部位快速聚集和增值 ，增强对抗原的摄取和提呈，同时可以刺激多种细胞因子分泌形成免疫活化微环境。商品化的油乳佐剂以诺华公司的MF59为代表，诺华使用美国PSS粒度仪的粒度解决方案进行颗粒分布、Zeta电位以及大颗粒检测，尤其是通过分析大颗粒来进一步改善佐剂的稳定性。

脂质体包裹目的抗原，发挥佐剂的作用。脂质体疫苗与巨噬细胞的细胞膜融合，将蛋白质递送入细胞质内，进入MHCⅠ类途径，激活CD₈⁺T细胞。其作用机制与铝佐剂相似，具有储存库效应，并可以增强APC对抗原的摄入。在过去的20年里，开发了大量的以脂质体为基础佐剂的疫苗，目前已有商品化脂质体佐剂上市。

聚合物微粒

可生物降解聚合物纳微颗粒作为疫苗佐剂具有*的优势，己成为近年来的关注热点，聚合物纳微颗粒除了具有颗粒型佐剂共有的保护抗原免受酶解、抗原储库、APCs鞭向性、调节免疫提呈途径、淋巴结靴向性等优势之外，还具有易于表面修饰、稳定性好、安全性好等优点。常用于纳微颗粒制备的聚合物材料可分为合成高分子材料和天然高分子材料，以PLGA微球为载体佐剂的HER-2多肽疫苗和HIV DNA疫苗已进入临床试验阶段。

在过去的几十年的时间里，学者们对铝佐剂的作用机理开展了深入研究，同时也开发了大量的新型疫苗佐剂，除了上述提到的，还有免疫刺激复合物、病毒样颗粒、细胞因子等等新型疫苗佐剂，其中有成功亦有失败。每个佐剂的作用机制都非常复杂，体外研究很难破解。佐剂的安全性至关重要，因此，未来的工作重点之一应是深入研究佐剂的作用机制，全面推测其对免疫系统的影响。

总结

粒径是纳微颗粒基本的属性之一，显著影响颗粒型疫苗佐剂的效果。粒径可以通过影响纳微颖粒与免疫细胞的相互作用以及颗粒向淋巴结的迁移效率等各个方面，终导致颗粒型疫苗效果差异。另外粒径是影响细胞对颗粒摄取行为的一个重要因素，不同粒径的颗粒以不同的途径被抗原提呈细胞摄取。一般情况下，20-200nm颗粒以受体介导的内吞作用被细胞摄取，而大于500nm的颗粒则以细胞饮和吞噬作用被细胞摄取。同样颗粒粒径也影响抗原提呈细胞的成熟速率。有研究表明，表面装载了抗原的50nm聚苯乙烯颗粒被细胞摄取以后迅速进入溶酶体，而500nm和3μm颗粒则在中性或弱酸性的吞噬体内，并未进入溶酶体。

表面电荷也是纳微颗粒的另一个重要理化特性，对颗粒与免疫系统的相互作用具有重要影响。体外细胞实验表明，阳离子颗粒比阴离子颗粒更容易被抗原提成细胞摄取，因为细胞膜表面为负电性，阳离子颗粒可以更有效结合到抗原提呈细胞表面，从而促进吞噬作用发生。

尽管研究颗粒粒径与其佐剂效应关系的工作很多，但研究结论并不一致，出现原因可能是多方面的，比如颗粒与抗原种类不同，抗原与颗粒结合方式不同，免疫途径和免疫程序不同等，除此之外，颗粒粒径分布也是导致粒径效应研究结果不一致的原因之一。一般来讲，粒径分布较宽，尾端存在大颗粒会导致颗粒稳定性较差，对于研究颗粒佐剂粒径效应工作而言，准备真实的获得粒径分布情况时前提和关键因素。

PSS粒度仪的整套检测方案，不仅可以检测粒径分布及Zeta电位，还能对尾端大颗粒进行计数分析，获得真实的粒径分布范围，从而保证研究中可以严格控制粒径分布，保证结果可信度。另外对于质量而言，可以分析批间差，确保每一批次的疫苗效果具有一致性。助力疫苗研发，愿*疫苗早日研发成功上市，战胜病毒，祖国山河无恙,人间皆安。