分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸、蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。我们实验室主要是用来测物质的光度以求得物质的浓度或者酶活。

基本原理

分子的紫外可见吸收光谱是由于分子 中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息，可以用标准光谱图再结合其它手段进行定性分析。

朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即

                              A= kcl

   式中比例常数k与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。

组成

  各种型号的紫外－可见分光光度计，就其基本结构来说，都是由五个基本部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器及信号指示系统。

1.光源

在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源。       

热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。

2．单色器

单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。

单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。

3.吸收池

吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池zui为常用。

4、检测器

检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。

5、信号显示系统

常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。

操作步骤

操作之前

1.1　开启电源进行初始化

开启主机电源，分光光度计将按屏幕所显示的项目进行自检和初始化，如下图所示。所有项目检测完毕，初始化结束，整个过程大约需要4min（若使用多池检测需5min）。每个项目进行初始化操作时将被加亮显示，当初始化完成后，该项右边的星标也将加亮显示。但是，如果检测到任何异常，初始化过程将立即中止，星标也不会加亮显示。

1.2　屏幕显示和触摸键盘

UV-1700的触摸键盘图可用数字键0~9和功能键F1~F4选择不同屏幕中的模式和设置。选择时，按下相应的数字键或功能键即可，无需按ENTER键确认。此外，输入数值时，如波长设置或显示模式等，必须按ENTER键确认输入值。

下面介绍每个键的基本功能，在不同屏幕下有一些键可能被赋予特殊的功能。

①   START/STOP键

　　一旦参数设置完成，可用该键开始和停止测量过程。

②   AUTO ZERO键

按该键，当前波长的吸光度自动调整为0（T）。测量前，必须确保在样品侧和参比侧中都放有盛有空白的比色池。

③   GOTOWL键

该键可用来改变当前的波长。

④   ENTER键

输入数值后，按该键确认。

⑤   Cursor光标键（＜（-），＞）

这组键可控制液晶显示屏幕中光标的左右移动。输入数值时，左光标键还可以用来输入负值（-）。

⑥   Function功能键（F1~F4）

这组键的功能与液晶显示屏幕下方所显示的功能相对应。

⑦   RETURN键

按下该键可返回当前屏幕的前一屏。

⑧   MODE键

用该键可从每种测量模式的参数设置屏返回到主模式屏。

⑨   Print打印键

用该键可输出当前屏幕显示的硬拷贝。

⑩   Numeric数字键

用该键可输入数值。

?   CE键

用该键可清除数值输入错误。按该键，已输入的数值将被清除，可重新输入正确的数值。

模式选择和共享操作

初始化完成后即显示模式选择屏幕

各种模式概述：

在模式选择屏幕下选择各种测量模式，即显示各自的参数配置屏幕。

①   光度模式

在固定波长下测量样品的吸光度或%透光率。

②   光谱模式

扫描波长范围以测量随波长变化的样品的吸光度和%透光率。也可进行单光束能量测量。对测得光谱可进行数据处理，如峰检出、平滑处理和数学计算等。

③   定量模式

用标准样品建立校正曲线，并对未知样品进行定量测量。

测量方法有：1、波长法；2、波长法；3、波长法；4、微分定量法。另外，可用下列方法建立校正曲线：K-系数法、单点校正曲线法、多点校正曲线法。

④   动力学模式

由吸光度随时间的变化计算酶的活性。

若使用多池支架（可选配），zui多可测量16个样品。以下是可供选用的测量方法：

1、波长动力学测量；2、波长动力学测量；3、多池动力学测量；4、速率测量。

⑤   时间扫描模式

该功能用于测量固定波长下吸光度、透光率或能量随时间的变化。使用多池支架（可选配）zui多可测量16个样品，还可以对测得数据进行数学计算等数据处理。

⑥   多组分测量模式

可定量分析zui多8种组分的样品。使用每种组分的纯品作标准样品，制作校正曲线，进行定量测量。

⑦   光度测量（多波长）

zui多可8个任意波长，然后分别测量每个波长处的吸光度和透光率。测得吸光度后，可选择三个计算式中的一个，对zui多为四个波长下的测得数据进行计算，并输出测量结果。

·2波长处测得值间的比值/差值和3波长测量值的计算

·用四数据计算式进行计算：(K1A1+K2A2+K3A3+K4A4)×K5

·用四数据计算式进行计算：K5×(K1A1+K2A2)/(K3A3+K4A4)

Kn：相关系数；An：吸光度。

⑧   可选配程序包

使用可选配程序包时选用此模式。可选配DNA/蛋白质程序包。

⑨   公用模式

在该模式下可设置和改变仪器的基本操作参数。

光度测量

操作步骤如下：

1、在模式选择屏幕中选择＜1. Photometric光度＞选项，将显示参数配置屏幕。

2、用GOTOWL键设定测量波长。

3、按F2键设定进样控制。

3、按START/STOP键时，测量开始，显示测量屏幕。

4、如需做空白校正，应在测量前先设置空白样品，然后按AUTOZERO键，将测量值置为0ABS（）。

注意事项

?    1、比色皿使用时注意不要沾污或将比色皿的透光面磨损，应手持比色皿的毛面。

?    2、待测液制备好后应尽快测量，避免有色物质分解，影响测量结果。

?    3、测得的吸光度A控制在0.2~0.8之间，超过1.0时要做适当稀释。

?    4、开关试样室盖时动作要轻缓。

?    5、不要在仪器上方倾倒测试样品，以免样品污染仪器表面，损坏仪器。

?    6、比色皿在盛装样品前，应用所盛装样品冲洗两次，测量结束后比色皿应用蒸馏水清洗干净后倒置晾干。若比色皿内有颜色挂壁，可用无水乙醇浸泡清洗。

?    7、向比色皿中加样时，若样品流到比色皿外壁时，应以滤纸點干，镜头纸擦净后测量，切忌用滤纸擦拭，以免比色皿出现划痕。

?    8、测定紫外波长时，需选用石英比色皿。

?    9、测量过程中不可打开测量室的窗门，否则会影响测量结果的准确性。

维护和保养

?    1、仪器使用一定周期后,内部会积累一定量的尘埃,由维修工程师或在工程师指导下定期开启仪器外罩对内部进行除尘工作,同时将各发热元件的散热器重新紧固,对光学盒的密封窗口进行清洁,必要时对光路进行校准,对机械部分进行清洁和必要的润滑,zui后,恢复原状,再进行一些必要的检测、调校与记录.

?    2、环境中的尘埃和腐蚀性气体亦可以影响机械系统的灵活性、降低各种限位开关、按键、光电偶合器的可靠性,也是造成必须学部件铝膜锈蚀的原因之一.因此必须定期清洁,保障环境和仪器室内卫生条件,防尘.

?    3、温度和湿度是影响仪器性能的重要因素.他们可以引起机械部件的锈蚀,使金属镜面的光洁度下降,引起仪器机械部分的误差或性能下降;造成光学部件如光栅、反射镜、聚焦镜等的铝膜锈蚀,产生光能不足、杂散光、噪声等,甚至仪器停止工作,从而影响仪器寿命.维护保养时应定期加以校正.应具备四季恒湿的仪器室,配置恒温设备,特别是地处南方地区的实验室.