一、制片

    选无自发性荧光的石英玻片或普通玻片，洗净后浸泡于无水乙醇等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。
二、固定

    除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。
    固定的作用有三：
    1.  防止标本从玻片上脱落。
    2.  除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果。
    3.  固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。

    标本的固定原则是：
    1.  不能损伤细胞内的抗原。
    2.  不能凝集蛋白质。
    3.  不能损伤细胞形态。
    4.  固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。
三、水洗

    固定后以冷的0.01 Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，zui后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
四、染色

    染色分直接染色法与间接染色法。

    1.  材料与试剂

    （1）荧光抗体，稀释至应用浓度。

    （2）0.01 Mol/L pH7.4PBS液

    （3）9份甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。

    （4）带盖方盘

    2.  直接染色法

    （1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min~45min。

    （2）PBS冲洗3次，每次冲洗3 min，即3×3冲洗。

    （3）蒸馏水冲洗。

    （4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。

    3.  间接染色法

    （1） 检查抗原：
    ①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30 min。
    ②以PBS液3×3冲洗。
    ③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30 min。
    ④PBS 3×3冲洗。
    ⑤H2O冲洗，凉干。
    ⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。

    （2）检查抗体：
    ①免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定。
    ②滴加相应抗原液（按1：100~1：500稀释），37℃孵育30 min。
    ③PBS液3×3冲洗。
    ④加荧光抗体，37℃孵育30 min。
    ⑤PBS液3×3冲洗。
    ⑥水洗，凉干。
    ⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。