小动物活体成像，是分子影像学的一种，主要通过生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术来进行。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记。
自从1999年，美国哈佛大学Weissleder等人提出了分子影像学（molecular imaging）的概念后，科学研究已不再局限于从肉眼观察身体、生理和代谢过程在疾病状态下的变化，而开始了解疾病的特异性分子事件。
与传统的体外成像或细胞培养相比，分子映像学具有着显著优点。首先，能够反映细胞或基因表达的空间和时间分布，第二，可以对同一个研究个体进行长时间反复跟踪成像，提高了数据的可比性，又不需要杀死模式动物。第三，在药物开发方面，为解决临床药物的安全问题提供了广阔的空间，使药物在临床前研究中通过利用分子成像的方法，获得更详细的分子或基因水平的数据，为新药研究的模式带来了革命性的变革。
作为分子影像学的方法之一，小动物活体成像技术越来越广泛地被应用到了各个研究领域。这项技术主要就是利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。相比之下，可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据更加真实可信。另外, 这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度*，不涉及放射性物质和方法, 非常安全。 因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点, 在刚刚发展起来的几年时间内，已被广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。
因此，获得高质量的生物荧光和荧光成像的图片，对于进一步的实验分析是至关重要的。而这一过程中，有许多因素影响成像的效果，那么究竟是哪些因素是zui关键的呢？北京博益伟业仪器有限公司在多个实验的基础上，总结、分析，明确了如下几个因素对活体成像结果起主要的影响作用：
一：CCD的性能
小动物活体成像系统主要包括以下几部分，背部薄化CCD，密闭暗箱，*以及软件分析系统等。其中，CCD性能的好坏直接决定了图像的质量。而CCD的性能高低主要从以下几个方面来考虑：分辨率、速度和强度。这三方面分别受不同的因子所限制，其中，分辨率主要取决于像素的多少和CCD尺寸的大小；速度主要与信噪比、灵敏度和读出率有关；强度的参照指标则为动态范围，如下图：

1 CCD的尺寸和像素的大小直接影响CCD成像的能力。
大像素点能够增加灵敏度，像素面积越大，对光越灵敏，因为像素点面积有更多电子，能产生更多信号。如，高bin值拍摄时，采用的大像素点拍摄的方法，这样能够获取更多的信号，拍摄到微弱的发光点； 然而，随之而来的问题是，由于像素点的增大，其分辨率明显下降，导致了图像的清晰度差，甚至出现马赛克现象。
小像素点能够增加分辨率，因此要提高影像质量就必须增加CCD的像素，然而在CCD尺寸一定的情况下，增加了像素就意味着要缩小了像素中的光电二极管。而单位像素的面积越小，其感光性能越低，信噪比越低，动态范围越窄，因此采用这种方法并不能无限制地增大分辨率，所以，如果不增加CCD面积而一味地提高分辨率，只会引起图像质量的恶化。但如果在增加CCD像素的同时想维持现有的图像质量，就必须在至少维持单位像素面积不减小的基础上增大CCD的总面积。而目前更大尺寸CCD加工制造比较困难，成品率也比较低，因此成本也一直居高不下，这也就是Roper 公司提供的Lz 2048B价格较高的原因了（Lz 2048B的CCD尺寸为27.6 x 27.6mm）。

2 动态范围的变化以bit值来表现，用来描述生成的图像所能包含的颜色数，即灰阶。深度是16位意味着图像含有216种颜色深度的变化，这样级别的CCD才能准确表现所检测到的荧光信号的微小差异，进而在图像上表现出不同的深浅或色彩差异。

3 对于同样级别的CCD芯片来讲，信噪比的高低则对zui后的成像质量更为关键，因为信噪比不仅与CCD本身有关，更与系统的整体配置和环境密切相关。
下面这个公式显示了信噪比（SNR）的计算方法，

从中可以看到，QE值，读出噪声和暗噪声是影响SNR的主要因素，单纯强调任何一个方面都不具有实际意义。
Roper公司生产的CCD，其zui大的特色就是具有非常高的量子效率。与其它厂家的CCD相比，在500-700nm范围内，Roper CCD的量子效率为 〉90%，即使低于在400nm和高于700nm的范围内，量子效率也能够达到40%以上，这样为获得高质量的图片提供了一个必要的条件。
温度，一直以来也是研究人员所关注的重要影响因素之一，但事实上，在信噪比的计算中，只有暗电流是与温度相关的。一般情况下，温度越低，因温度产生的暗噪声也就越低；但是，当温度降低到一定程度时，乱真电荷（spurious charge）就会出现，从而增加了暗电流的值。因此，温度对于CCD来讲，并不是越低越好，而是有一个*值，即：既降低了温度带来的噪声，又没有引起乱真电荷的增加。Roper公司设计生产的1300B，采用液氮制冷，芯片温度控制在-110℃，其原因正在于此，这是一个保证CCD工作状态，且不会产生高噪声的*温度。

二：实验所采用的细胞和基因的表达情况
对于活体成像实验来讲，许多实验都涉及到了利用活细胞系来进行研究，而不同的细胞系，表达蛋白的能力也不同，因此实验采用的细胞系的好坏，很大程度上影响了荧光成像的结果。
重组基因或融合蛋白的表达情况同样直接影响荧光的强弱，这个过程主要是由启动子的强弱来控制的。如果实验中采用了弱启动子，那么在荧光检测时，很可能会导致荧光弱很多倍，这样，即使有表达的部位，也可能因此而无法检测到，北京博益伟业仪器有限公司的实验结果证明了这一点。以下图为例，A图采用了强启动子，在平板实验中，20个细胞就可以在1*1 bin，60秒被检测到，而B图中所采用的弱启动子，在8*8 bin，60秒时却只能检测到1250个细胞。

三：荧光素酶成像时，底物浓度和温度的影响

哺乳动物生物发光，是将荧光素酶基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。
正因为荧光素酶成像是一种酶和底物的生化反应，因此，生物荧光成像便不可避免地受到了底物浓度和动物体温度的影响。在对动物进行底物注射时，底物浓度的高低和量的多少都会对成像的快慢和荧光的强弱造成影响。而活体成像系统的暗箱和检测平台都保持良好的恒温状态，也正是为了成像时能够保证动物的体温恒定在37℃。下面两图直观地说明了底物浓度和温度对于酶活性的影响：

综上所述，在进行小动物活体成像时，必须综合考虑各方面因素的作用，尽量将各个因素都保证在*状态，才能得到真正高质量的图片。

然而，在活体成像过程，并不是总能保持各方面因素都达到*状态，那么在这种情况下，应该从哪些方面考虑，去获得高质量的图片呢？北京博益伟业仪器有限公司通过对一系列的实验结果分析后，建议：
首先：构建带有强启动子的融合表达蛋白。这是整个活体成像的*步，也是zui重要的一步。从上面的分析可以看出，启动子的强弱对于zui终图片的获取影响甚大，强启动子对荧光强度的提高，是任何只从CCD性能方面进行改进所*的。
另外，值得注意的是，在进行平板预实验时，一定要将整个的实验过程严格控制，包括细胞的个数，底物的浓度以及环境的温度等。其中，环境温度有时会被忽视，但真正的成像是在体内进行的，如果平板实验的温度不准确，不处于酶和底物作用的*温度，那么就可能会导致获得结果的不准确性，造成下一步体内注射细胞的偏差，影响实验结果。下图是不同温度下，同样的细胞系，同样的个数获得的结果，可以看到，在温度降低后，能检测到的细胞个数明显减少。而这个结果实际上并不是CCD灵敏度发生了变化，而是环境温度的原因。

第二：在所采用的细胞系无法更改或提高其表达蛋白的能力时，应该考虑延长曝光时间。对于CCD成像来讲，获得的光子信号有一个累加效应，因此，当曝光时间增强时，微弱的光子信号得到了累加，从而可以被检测到。
第三：曝光时间的延长，不仅增加了目的信号，对于噪音也存在一个累加效应，为了避免这种情况，可以适当的增加bin 值，即采用高大像素点进行拍摄，这样获得更多的光子信号，适用于微弱信号的拍摄。

总之，了解了小动物活体成像系统的原理，以及影响成像的一些相关因素后，能够帮助研究人员更容易获得高质量的图片，进而形成一篇好的科学论文。不过，仪器只是论文成功的助因，zui重要的决定因素还是在于文章是否具有创新性，以及文章整体内容的丰富程度和含金量，希望我们的仪器能为科研工作者的文章增色许多