一、准备和安装过滤器 

清洗好过滤器，放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包好，用15磅20min进行高压灭菌处理。在超净台内打开并将过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中，用泵过滤后检查滤膜是否完好。 

二、合成培养基的配制：

1.根据细胞目录中的说明，按表选择合适品牌及货号的培养基干粉，用适量超纯水充分溶解。

2.按要求添加tan酸氢钠、gu氨酸钠等，充分搅拌使之溶解。

3.pH调至7.2左右。

4.加水至zui终体积。

5.在超净台中对溶液进行滤过除菌，分别装入250mL或500mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。

6.瓶口封存好，放入4℃的冰箱进行贮存。 

三、小牛血清的处理 

1.将血清加热至56℃并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。

2.处理后的血清贮存于4℃。

3.小牛血清在使用前进行筛选以掌握血清的质量。

四、生长培养基的配制 

1.除了无血清培养之外，各种合成的培养基在使用之前都需要加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。 

2.培养基分装成小瓶（100～200 mL）以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 

比例配制：基本培养基占80％--90％，小牛血清或胎牛血清占10％--20％。按1％的体积分数加入双抗贮存液（qing霉素+lian霉素），使qing霉素和llian霉素的终浓度分别为100U／mL和100μ／mL，。 

五、冻存细胞的复苏 

1.应遵循慢冻快融的原则。先将水浴锅调至37-37.5°，取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸至水面以下不断摇动至融化。 

2.在无菌台内将培养基加入到50ml的小培养瓶内，约5ml左右，然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞，置培养并内轻轻摇晃，使细胞均匀后置培养箱内培养。

六、传代 贴壁细胞:

对于贴壁细胞应先吸/倒 进培养基，吸干净，以免中和后加入的消化液使强度减弱。50ml培养瓶加入消化液约1-3ml，晃动使消化液铺均匀置37°培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入培养基后继续培养或实验。 

七、冻存 

将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收集，以培养基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约106ml。加入10%的DMSO。以每管1-2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70°C的冰箱冷冻。次日保存到液氮中。 

八、注意事项

玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:

1）高压蒸汽灭菌15分钟以上;

2）干烤消毒140度2小时以上; 

3）无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上;

4）各种培养板照射3小时以上; 

培养基（pH7.2）和血清配制好后要做无菌试验:

1.将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4度保存; 

2.消化液（pH7.8）或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20度保存;

3.培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外线的应照射1小时以上，如有高温灭菌的应按程序来菌）。至少每月一次。 

进入操作时应注意先清洗双手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作时注意无菌台内空间层次。手及物品不要在暴露的瓶口上方，如果数量较多，培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作，瓶与瓶之间应相隔一定的距离，开瓶时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧，打开后先用灯先烧口，再烧盖。用完后同样操作。整个操作过程需靠无菌台近点。